酶法合成脱氧鸟苷三磷酸和鸟苷三磷酸

发布时间：2020-07-18 00:14

【摘要】：脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和鸟苷三磷酸(GTP)是体内合成DNA或RNA的前体,同时也作为基于PCR技术发展而来的各种现代生物技术的重要原料。研究中我们使用渗透化共表达鸟苷酸激酶和乙酸激酶的全细胞生物合成dGTP和GTP,同时也探索了细菌细胞表面展示构建的全细胞催化剂于生物合成反应中的运用。我们将保加利亚乳杆菌的鸟苷酸激酶和大肠杆菌的乙酸激酶编码基因gmk和ack克隆进质粒pET28-a中,构建两株单基因表达菌。然后利用载体上的同尾酶酶切位点构建双基因共表达菌,根据串联顺序命名为pAG和pGA。经过诱导表达后,在25 ℃下使用10 mM EDTA处理菌体30 min,酶活力相对于粗酶液损失较小,在37 ℃催化5 mM底物dGMP,反应2.5 h后,底物转化率为91%;催化5 mM GMP,反应1.5 h后,转化率为95%。通过与冰核蛋白的N末端或N、C末端融合体相连,我们成功在大肠杆菌细胞表面展示了鸟苷酸激酶和乙酸激酶。使用0.2 mM IPTG在25 ℃下诱导表达30h可以获得大量可溶性目标蛋白。使用表面展示酶37 ℃下催化5 mM底物dGMP,反应4 h后,转化率达到91%;催化5 mM底物GMP,反应3 h,转化率达到95%。并且其在37 ℃下稳定性很好,经过9次重复回收后,仍保持50%以上的酶活性。合成反应通过偶联一个乙酸激酶催化的ATP循环再生用于提供核苷酸磷酸化过程所需的磷酸基团,大大降低了生产成本。研究发现,只需添加起始底物浓度二十分之一的ATP便可满足反应所需。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55;Q78
【图文】：

制反应体系中磷酸供体（ＮＴＰ）的添加量为０．２５ｍＭ，底物浓度为５ｍＭ，邋ＡＣＫａｓｅ的添逡逑加量为２昭。对于ＧＴＰ合成反应，加入３．７８肫ＧＭＫａｓｅ。对于ｄＧＴＰ合成反应，加入逡逑３７．８邋ｐｇ邋ＧＭＫａｓｅ。如图２．４所示，无论是在ＧＴＰ合成反应还是ｄＧＴＰ合成反应中，ＡＴＰ逡逑作为磷酸供体时，底物转化率最高。反应６ｈ后，底物ＧＭＰ转化率达到９５％，底物ｄＧＭＰ逡逑转化率达到９１％。而ＵＴＰ，ＣＴＰ和ＧＴＰ作为磷酸供体T，效果很差。逡逑

循环来降低生产成本。逡逑由于在反应中，ＡＴＰ仅作为转运磷酸基团的中介，过多的ＡＴＰ并＋能提高反应的转逡逑化字．。因此迎过改变磷酸供休ＡＴＰ的起始浓度来探究Ｍ适的ＡＴＰ浓度，结果如图２．５所逡逑ＴＪｎ邋0逡逑对于ＧＴＰ合成反应，反应起始时加入０．２５邋ｍＭ的ＡＴＰ（底物ＧＭＰ起始浓度的丨／２０），逡逑反应６邋ｌｉ后，ＧＭＰ的转化韦达到９５°／。，与起始加入０．５邋ｍＭ邋ＡＴＰ的底物转化率丨ＮＭ。这逡逑意味着反应起始时加入０．２５邋ｍＭ的ＡＴＰ即ｗ丨满足反应需求。继续减少ＡＴＰ浓度会降低逡逑

本章所涉及的试剂、仪器以及实验方法，若无注明，则与第２章相同。逡逑３．１．１共表达重组菌株的构建逡逑将在第２章屮构建好的ＧＭＫａｓｅ和ＡＣＫａｓｅ重组菌过夜培养后，抽提质粒。如图３．１逡逑所示，将重组质粒依照构建方案在３７邋°Ｃ邋Ｆ双酶切反应３邋ｈ，为了探究以说和基因在逡逑质粒上串联的前后顺序对重组菌共表达的影响，我们构建了共表达重组菌ｐＧＡ和ｐＡＧ，逡逑分别以ｇＭ在上游，ｏｄ在下游和以0＜：々在＿丨：游，ｇｗ丨在卜游。逡逑构建好的重组质粒ｐＧＡ和ｐＡＧ分别转化到大肠杆菌感受态细胞ＤＨ５ｃｔ中，过夜培逡逑养后，挑取平板ｈ的单

本文编号：2760121