产鼠李糖脂生物表面活性剂防御假单胞菌的构建与优化

发布时间：2020-07-18 05:25

【摘要】：鼠李糖脂(Rhamnolipid)生物表面活性剂主要通过铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)发酵法生产获得,但是铜绿假单胞菌较强的条件致病性限制了其在工业中的应用。利用基因工程手段构建一株相对安全且高效的鼠李糖脂生产菌株,是目前该领域研究的重点。本研究利用假单胞菌的重组酶系统敲除防御假单胞菌Pf-5(Pse-udomonas protegens Pf-5)的羟基脂肪酸合成编码基因pha,从而消除鼠李糖脂合成的竞争性抑制作用,增加鼠李糖脂产量。与此同时,通过两亲本接合转移的方法整合来源于P.aeruginosa PAO1的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhlAB)于Pf-5基因组中。本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因的表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(P_(apra)、P_(tac)和P_(rhaB))成功替换了P.aeruginosa PAO1中的P_(RhlAB)原始启动子,构建了表达载体pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,p-BBR1-kan-P_(tac)-RhlAB和pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB,并将这些表达载体分别在P.protegens Pf-5中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。在LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,Pf-5/pBBR1-genta-RhlA B的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂产量分别是11.135 mg/L,441.135 mg/L,557.764 mg/L,启动子优化后鼠李糖脂产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。进一步对工程菌株进行培养基优化,以1%的葡萄糖为碳源的LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pB-BR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为18.778 mg/L,38.859mg/L,375.742 mg/L,418.551 mg/L。在以橄榄油为碳源的LB培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pBB-R1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为30.208 mg/L,55.011 mg/L,937.887 mg/L,844.517 mg/L。以1%的橄榄油为碳源的PG培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为403.27 mg/L,522.034 mg/L。以1%的橄榄油为碳源的MSP培养基中摇瓶发酵至42 h时,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂产量分别为410.022 mg/L,586.079 mg/L。获得了最优生产鼠李糖脂工程菌Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,鼠李糖脂产量达到937.887 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR定量分析rhlAB基因,在P_(apra),P_(tac)和P_(rhaB)启动子调控下,rhlAB基因的相对表达量分别是原始启动子调控下的0.93,2.16和2.77倍。本研究首次在防御假单胞菌Pf-5中对rhlAB基因进行了调控功能研究,利用定向遗传改造的方法成功构建了鼠李糖脂高产菌株,为实现鼠李糖脂rhlAB基因异源高效表达和合成调控奠定了相关基础。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

重组载体 pBeloBAC11-oriT-TnpA-genta-RhlAB。将重组载体 pBeloBAC11-oriT-TnpA-genta-RhlAB 电转入 ET12567 菌株用于接合转移，鼠李糖脂基因 rhlAB 通过随机转座整合到 Pf-5/ pha 菌株的基因组上，最终获得 Pf-5/ pha-rhlAB。2.5 同源重组构建鼠李糖脂操纵子相关的表达载体2.5.1 构建重组载体 pBBR1-genta-Papra-RhlAB以载体 p15A-cm-apra 为模版，以 Papra-RhlAB-5'/Papra-RhlAB-3'为引物，扩增两端带有质粒 pBBR1-genta-RhlAB 上 rhlAB 原始启动子两侧同源臂的 apra+rbs（1011 bp）线性载体片段。将得到的 apra+rbs 线性片段与质粒载体 pBBR1-genta-RhlAB 一起电转入通过 L-阿拉伯糖诱导剂诱导的 E. coli GB05-red，在重组酶的作用下发生细胞内同源重组，apra+rbs 线性片段与质粒载体 pBBR1-genta-RhlAB 经同源臂退火杂交结合成环状，从而形成重组载体 pBBR1-genta-Papra-RhlAB，如图 2-1。

从而形成重组载体 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,如图2-2。图 2-2 通过线环重组构建质粒 pBBR1-kan-Ptac-RhlABFigure 2-2 Constructions of pBBR1-kan-Ptac-RhlAB by LCHR2.5.3 构建重组载体 pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB以载体 pBBR1-kan-PrhaB为模版，以引物 Rha-RhlAB-5'/Rha-RhlAB-3'扩增两端带有质粒 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB 上 Ptac启动子两侧同源臂的 kan+rhaS+rhaR+PrhaB（3321 bp）线性载体片段。将获得的 kan+rhaS+rhaR+PrhaB线性片段与质粒载体 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB一起电转入通过 L-阿拉伯糖诱导剂诱导的 E. coli GB05-red，在重组酶的作用下发生细胞内同源重组，kan+rhaS+rhaR+PrhaB线性片段与质粒载体 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB 经同源臂退火杂交结合成环状，从而形成重组载体 pBBR1-kan-PrhaB-Rhl-AB，如图 2-3。

图 2-3 通过线环重组构建质粒 pBBR1-kan-PrhaB-RhlABFigure 2-3 Constructions of pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB by LCHR2.6 鼠李糖脂表达载体转化入防御假单胞菌 Pf-5将测序正确的重组质粒 pBBR1-genta-RhlAB，pBBR1-genta-Papra-RhlAB，pBBR1-kan-Ptac-RhlAB，pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB 通过常温电转化法转入防御假单胞菌 Pf-5 中，图 2-4 为本研究中构建 Pf-5 重组工程菌流程图。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 汤晓;张国亮;孟琴;;铜绿假单胞菌分泌鼠李糖脂能力对原油降解影响的研究[J];高校化学工程学报;2008年01期

2 谈菲;刘智峰;钟华;曾光明;袁兴中;;低浓度鼠李糖脂单糖脂在近中性溶液中的聚集行为[J];中国环境科学;2014年11期

3 刘波,张红梅;鼠李糖脂应用于三次采油的实验研究[J];油气采收率技术;1997年03期

4 周超俊;沈冲;程层;孟琴;;响应面法优化鼠李糖脂水解条件[J];化学反应工程与工艺;2018年01期

5 蔡京荣;吕佳佳;;生物表面活性剂鼠李糖脂研究概况[J];中国洗涤用品工业;2019年04期

6 张熠;刘洋;陈鹏;邱平;;铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的研究[J];食品与发酵科技;2019年01期

7 李南臻;王刚;万玉军;庹有朋;罗丽娟;岳晓敏;;产鼠李糖脂铜绿假单胞菌的选育及其发酵条件的优化研究[J];食品与发酵科技;2018年01期

8 张晨,浦跃武,梁世中,刘志伟;发酵法生产鼠李糖的研究现状[J];四川食品与发酵;1998年Z1期

9 梁恺;陈波水;张楠;方建华;;鼠李糖脂对全损耗系统用油生物降解性能及润滑性能的影响[J];合成润滑材料;2011年04期

10 张培苹;;鼠李糖脂水溶肥料对苹果农艺性状及产量的影响[J];农业科技通讯;2014年10期

相关会议论文 前10条

1 赵力;金艳方;石梅;沈玉江;徐远洋;李伟;;鼠李糖脂生物表活剂的性能评价及应用[A];中国化学会第26届学术年会化学生物分会场论文集[C];2008年

2 崔长征;曾驰;张甲耀;沈萍;;一株高产鼠李糖脂菌株的分离鉴定及其相关基因的克隆与表达[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

3 张潇予;胡勇有;林晖;;不同组分鼠李糖脂对三氯生在水/底泥中吸附行为的作用[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年

4 辛明秀;李倩;宋子煜;;以乙醇为碳源生产鼠李糖脂生物表面活性剂[A];第二届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文摘要集[C];2010年

5 万金忠;张胜田;林玉锁;林琳;李群;周艳;应蓉蓉;吴运金;邓绍坡;何跃;;鼠李糖脂-柠檬酸联合增溶有机氯农药的效果研究[A];2015年中国环境科学学会学术年会论文集[C];2015年

6 万金忠;孟蝶;张胜田;李群;周艳;林玉锁;;鼠李糖脂-柠檬酸联合对林丹-重金属复合污染土壤的同步强化解吸效果研究[A];2017中国环境科学学会科学与技术年会论文集（第二卷）[C];2017年

7 朱ng;姚斌;孟琴;;铜绿假单胞菌利用烹饪废油发酵产鼠李糖脂的研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（上）[C];2006年

8 张国亮;左文蕊;孟琴;汤晓;;油田废水脱盐用于生物表面活性剂鼠李糖脂的发酵[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年

9 章宏梓;张国亮;孟琴;;鼠李糖脂发酵液用于罐底油泥原油回收[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（下）[C];2006年

10 张栋;杨磊;张爽;;鼠李糖脂-Tween80对PAHs土-水界面行为的影响[A];浙江省环境科学学会2014年学术年会论文集[C];2014年

相关博士学位论文 前10条

1 刘洋;鼠李糖脂协调石油烃类污染物生物降解的机制研究[D];湖南大学;2018年

2 梁生康;鼠李糖脂生物表面活性剂对石油烃污染物生物降解影响的研究[D];中国海洋大学;2005年

3 李清心;鼠李糖脂合成酶Rh1A和Rh1B基因的克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究[D];山东大学;2005年

4 沈薇;生物修复环境污染的微生物筛选及其性能研究[D];南京理工大学;2006年

5 傅海燕;生物表面活性剂鼠李糖脂改善堆肥介质微环境的作用机制及在堆肥中的应用研究[D];湖南大学;2007年

6 郝东辉;采油微生物筛选、鼠李糖脂产脂性能及关键酶基因克隆与表达研究[D];山东大学;2008年

7 钟华;鼠李糖脂的菌体吸附及其对菌体表面的改性作用研究[D];湖南大学;2008年

8 赵峰;厌氧产鼠李糖脂菌株Pseudomonas aeruginosa SG的特性及原位驱油潜力研究[D];哈尔滨工业大学;2016年

9 郭艳平;鼠李糖脂作用下17α-炔雌醇在水/底泥中的迁移转化规律及生物有效性[D];华南理工大学;2010年

10 沙如意;鼠李糖脂的发酵、分离及应用研究[D];浙江大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 黄朝;铜绿假单胞菌DN1高产鼠李糖脂基因工程菌株的构建及其对石油污染土壤修复的实验研究[D];西北大学;2019年

2 谢芝玲;产鼠李糖脂生物表面活性剂防御假单胞菌的构建与优化[D];湖南师范大学;2019年

3 徐建昌;鼠李糖脂气液界面吸附和溶液自组装行为pH响应机理的分子动力学模拟研究[D];中国石油大学(华东);2017年

4 文芳;微拟球藻PJ12的二十碳五烯酸和假单胞菌ZS1的鼠李糖脂生物合成调控的转录组分析[D];浙江大学;2019年

5 张澄;铜绿假单胞菌产鼠李糖脂发酵条件优化与产物性质研究[D];浙江大学;2018年

6 缪书舟;Cry1Ac蛋白在二氧化硅表面吸附及解吸行为的研究[D];湖南大学;2018年

7 张翠坤;产鼠李糖脂菌株的筛选及降解原油能力的分析[D];天津科技大学;2015年

8 卢剑;鼠李糖脂在铜绿假单胞菌NY3代谢烃过程中的生理作用研究[D];西安建筑科技大学;2015年

9 钟亮;鼠李糖脂在含烃污染物处理中的应用研究[D];浙江大学;2015年

10 陈茜;鼠李糖脂增强淋洗结合生物炭吸附修复污染土壤中的菲[D];华中科技大学;2016年

本文编号：2760477