杆状病毒口服感染因子PIF5功能初步研究

发布时间：2020-07-18 07:52

【摘要】：杆状病毒是一类大的环状DNA病毒,能特异性感染无脊椎动物。杆状病毒有两种存在形式:出芽型病毒粒子(Budded Virus,BV)和包埋型病毒粒子(Occlusion-Derived Virus,ODV),分别介导系统感染和口服感染。其中口服感染是由ODV囊膜上的口服感染因子介导的,目前在杆状病毒中发现有10种口服感染因子,即PIF0~PIF9。部分口服感染因子可以形成稳定的复合物,该复合物有助于病毒入侵,但是PIF5并不参与复合物的形成,也不会影响该复合物的形成;在所发现的口服感染因子中,pif5转录水平最高,但是PIF5在口服感染过程中的作用仍然不清楚。为了研究PIF5对病毒粒子产生和感染的影响,本论文先研究研究苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)PIF5对病毒粒子BV和ODV形成的影响。检测pif5基因的转录时相和表达时相,结果显示pif5是一个晚期基因;PIF5是ODV囊膜的特异蛋白,在病毒感染过程中定位于细胞核内微囊泡和ODV囊膜上;通过同源重组和转座构建缺失型和回复型重组病毒,结果显示缺失pif5并不会影响BV的产生和感染,也不影响ODV的形成和包埋、OB的形态及OB中ODV的数量,但是它影响ODV的口服感染能力及感染Sf9细胞的能力。为了研究PIF5在口服感染过程中的作用,我们对截短型PIF5蛋白进行表达及纯化。通过原核表达系统获得可溶的PIF5-P-T1蛋白,纯化时发现该蛋白有多种存在形式:单体和多聚体;对该蛋白纯化方法优化后,蛋白单体比例增加;通过真核表达系统获得可溶表达的PIF5-E-T1蛋白,并筛选稳定表达该蛋白的细胞系。同时从中肠中提取刷状缘膜囊泡;通过far-western blot检测到PIF5-P-T1和PIF5-E-T1蛋白与提取的中肠细胞刷状缘膜囊泡(Brush broder membrane vesicle,BBMV)有相互作用;通过Pull-down及质谱鉴定来寻找病毒入侵过程中与PIF5进行作用的宿主蛋白。同时对外源表达的PIF5-P-T1蛋白与BBMV进行共孵育,发现PIF5-P-T1蛋白的特异性剪切,推测BBMV可能促进PIF5的剪切。本论文通过研究PIF5对BV产生和感染、ODV包埋及OB形态的影响,截短型PIF5蛋白的表达与纯化,截短型PIF5蛋白与BBMV相互作用等,初步揭示了PIF5的功能,为研究口服感染因子介导杆状病毒口服感染的分子机制打下基础。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q939.4
【图文】：

杆状病毒,病毒粒子,核型多角体病毒

病毒是不同种；如果平均每个位点的替换数介于同种病毒的不同亚型（Jehle et al.，2006）。γ-属 NPV，其中红头松树叶蜂核型多角体病毒（Neovirus，NeleNPV），松黄叶蜂核型多角体病毒（Novirus，NeseNPV）和冷杉叶蜂核型多角体病毒（Novirus，NeabNPV）不编码典型的膜融合蛋白（F-蛋在中肠中进行复制（Arifetal.，2011）。δ-属杆状蚊核型多角体病毒（Culex nigripalpus nucleop该病毒有 BV 和 ODV 两种形态，在感染后期形成包涵体呈球状，但没有同源的多角体蛋白或同源2006）。的结构

形态,多角体,多角体蛋白,杆状病毒

杆状病毒口服感染因子 PIF5 功能初步研究的病毒绝大部分是 SNPV。在病毒感染晚期，细胞核内形成的 ODV 包埋进多角体中形成 OB，在境下，多角体可以保护 ODV 病毒（Rohrmann，2013）（图 1.2）。多角体蛋白是多角体蛋白，多角体蛋白形成三聚体，三聚体通过二硫键进一步形聚体，在高 pH 环境下，二硫键被破坏，OB 解聚（Rohrmann，2013；Jiet10）。多角体蛋白是杆状病毒中最保守的蛋白之一，但是在 δ-杆状病毒属发现其同源蛋白。OB 表面是一层光滑的膜，称为多角体膜，可以将病毒环境隔离，增强多角体的稳定性，其组装与多角体膜蛋白（PEP）和 P10 关（Patmanidi et al.，2003；Lee et al.，1996）。多角体膜与传统意义上的脂层囊膜不同，该膜有多孔，在中肠碱性条件下可以让阴离子快速通过，角体膜释放 ODV，感染中肠细胞。

二次感染,杆状病毒

图 1.3 杆状病毒初始感染和二次感染（Blissard and Theilmann，2018）初始感染：OB 进入中肠后碱解释放 ODV，ODV 穿过围食膜与中肠上皮细胞的微绒毛结合和膜融合；病毒进入细胞后进行复制并组装核衣壳，通过出芽的方式产生成熟的 BV。BV 通过血液循环或者直接感染其它细胞组织，在感染早期细胞产生 BV 而在感染晚期产生 ODV。最后 ODV 包埋形成 OB，细胞裂解及昆虫死亡液化。Figure 1.3 Baculovirus virion primary infection and secondary infection (Blissard anTheilmann，2018)Primary infection is that OBs are disassembled and release ODVs into midgut. ODVs biand fuse with microvilli of midgut epithelialcells aftertraversing peritrophic membrane (PMIn cells, viruses replicate and the assembled nucleocapsid bud to generate mature BVs. BVmay infect other cells directly or by circulating in hemolymph. The infected cells by BV

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