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液态活检多模板(CTC、cfDNA、WBC)二代测序技术优化

发布时间:2020-07-18 21:14
【摘要】:从癌症现状数据来看,癌症已然成了人类死亡的主要原因,而中国人群无论在癌症发生率还是死亡率都占了全世界大约50%的比例。自测序技术的迅速发展以来,肿瘤液态活检相关的检测应用越来越热门,液态活检结合测序的技术应用更是给癌症治疗带来的新的解决方案和方向。本研究基于珠海圣美生物医疗诊断技术有限公司多模板(cfDNA、CTC、WBC)二代测序技术,对整个技术流程进行了实验操作优化研究,论文先用细胞系样本进行优化验证,再用实际病例样本对优化前后的病例结果进行对比分析,证实优化后流程的改善效果。本文中的样本会用LiquidBiopsy(Cynvenio Biosystems)系统对全血细胞进行富集纯化得到CTC(CTC样本),每一份病人全血样本留取血浆样本(cfDNA样本来源),WBC样本(个体对照样本),再用ThermoFisher文库构建试剂盒及Ion torrent测序平台进行二代测序,测序数据经过公司内部生物信息分析软件Target call对三种样本进行成对分析,最后得到多模板(CTC\WBC\cfDNA)二代测序癌症热点突变位点。结果:(1)在细胞系验证实验过程中,cfDNA样本的提取操作优化明显提高cfDNA得率;CTC富集过程中芯片的预处理以及非提取直接裂解方法的优化研究,消除了二代测序建库过程中PCR扩增抑制物,优化后的操作可100%检出细胞系突变位点,对照优化前的操作则高至50%的机率会检不出。(2)在153例实际病例分析中,对优化前后的病例样本进行对比分析。优化前操作的69份病例cfDNA与CTC两组分均检出且有一致位点、两者均有检出无一致位点、单独cfDNA检出、单独CTC检出位点情况占比分别为21.74%、21.74%、15.94%、15.94%,合计有检出的占比为75.36%,未检出占比为24.64%;优化流程操作的84例病例的占比分别为21.43%、44.05%、17.86%,合计有检出的占比有92.86%,未检出占比为7.14%。优化流程明显增加了cfDNA与CTC的检出率;同时,优化前后的操作流程,都存在cfDNA或者CTC组分检出位点不一致的情况,优化前后流程操作的cfDNA与CTC检出有重合的位点占比约33.3%、45.2%。(3)多模板二代测序结果与PCR方法、一代测序平台进行了验证,17例病例三种方法检测一致性达到88%。(4)探索性的研究了非常规样本(胸水样本)的检测,全血中cfDNA组分未检测出突变位点,CTC中检测出突变位点,而随后胸水样本连续检测中,均检测出了一样的突变位点,检测表现了高度的一致性。结论:(1)优化流程明显提高了二代测序质量及细胞系突变位点检出情况,无论是在细胞系的验证还是病例分析中。同时优化流程增加了cfDNA与CTC两组分有重合位点的占比(优化前25.3%、优化45.2%),这表明cfDNA与CTC多模板测序的必要性,多模板二代测序检测能够一次检测得到更加完善的信息。(2)多模板二代测序结果与PCR方法和一代测序方法的验证结果(三者一致性88%)验证了多模板二代测序热点突变检测技术的可靠性,对突变检测技术应用提供了一个选择。(3)探索性的研究了非常规样本(胸水样本)的检测,胸水样本连续检测结果显示出高度的一致性,提示了其它形式的体液(如胸水、积液等)也有可能适用于这个技术平台,扩大本技术应用的可能。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R730.43;Q78
【图文】:

癌症,大洲,人口,占比


世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)于 2018 年 9 月发布了 2018 年最新全症统计数据[1][2],它提供了全球 185 个国家和地区 36 种癌症的发病率、死亡率相据。2018 年,全球共有 1810 万例新增癌症病例(950 万男性,860 万女性),死亡达 960 万(540 万男性,420 万女性),如图 1-1 所示,全球癌症负担进一步加剧。界 1/5 的男性和 1/6 的女性均可能会患癌,1/8 的男性和 1/11 的女性因癌症死亡。存活率,即患病 5 年后仍然活着的人数估计能达到 4380 万。图 1-1 数据显示,2018 全球几乎一半的新发癌症和超过一半的癌症死亡病例发生洲国家,一部分原因也是因为这些地区占有了全球近 60%的人口。虽然欧洲人口仅界人口的 9%,但它占全球新发癌症病例的 23.4%,占癌症死亡病例的 20.3%;美国占 13.3%,但新增病例占 21%,占癌症死亡病例的 14.4%。和世界其他区域,亚洲洲的癌症死亡率(57.3%和 7.3%)要高于他们的发生率(48.4%和 5.8%),主要由地区预后不良和发生死亡率高的癌症发生的情况更多;多数国家的癌症患者未能得时诊断,治疗的资源和渠道也有限。

分布情况,死亡率,世界,分布情况


图 1-2 上面是世界癌症发病率及死亡率分布情况[1]近年来我们会听到这么一个骇人听闻的数字,中国死亡案例中,死亡人数 2814200例,平均每天有 7700 多名患者死于癌症,这样算下来每分钟就有 5 人死于癌症,癌症在中国已逐渐成为各类疾病的最高致死率,这些数据来自于 2016 年发表在 CA 的 2015年中国癌症统计数据[3]。国家癌症中心在 2018 年 2 月发布了最新癌症数据,收集了 339家癌症登记点的数据,共覆盖中国 2.88 亿人群,下图 1-3 数据可以看出,我国癌症的发生率以平缓上升的一个状态,2007 年有所下降,但近几年又呈上升的趋势。死亡率稳步上升,至 2010 年有所下降,这几年来又出现上升走势。

分布图,走势图,死亡率,肺癌


图 1-3:中国癌症发生率与死亡率走势图[3]如下表 1-1 所示,中国癌症发病率和死亡率第一位的是肺癌,胃癌和肝癌仍是的主要负担,癌症发病率前 5 位的分布图中,女性乳腺癌的发病率仍是排在了这年来甲状腺癌的发病率有所增加,在性癌症排名中位第 4 位。右边癌症死亡 位提示肺癌是导致死亡的首要原因,肝癌与胃癌成了死亡主要负担。

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 李伟;马德亮;李燕;周冲;段卫明;练炼;陈凯;毛一香;陶敏;;转移性乳腺癌循环肿瘤细胞检测对化疗疗效的评价[J];中华肿瘤防治杂志;2015年24期

2 刘文静;刘毅;刘晓晴;;CellSearch系统检测循环肿瘤细胞及其分子标记的研究进展[J];临床肿瘤学杂志;2012年02期

相关博士学位论文 前1条

1 施建;循环肿瘤细胞检测的方法学建立及在中晚期肝细胞癌和结直肠癌肝转移中动态检测的应用研究[D];吉林大学;2017年



本文编号:2761432

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