miR-977在果蝇Toll免疫通路中的调控作用研究

发布时间：2020-07-19 18:50

【摘要】：非编码RNA在各种生命过程中扮演着极其重要的角色,特别是microRNA(miRNA)一直是生命科学的热点研究领域。miRNA能在转录后水平调控基因表达对维持生物体内的稳态起着关键的作用。众所周知免疫响应的过度激活或不足都会造成生物体不同程度的损伤甚至导致疾病,因此,深入研究miRNA在动物免疫稳态维持中的功能和调控机制具有重要的理论和实践意义。黑腹果蝇因其具有易饲养、生长周期短、雌雄易辨、完整的全基因组序列、以及遗传资源丰富等特点,已成为研究动物免疫功能和免疫响应机制的重要模式生物。果蝇先天免疫主要是通过激活Toll信号通路与Imd信号通路产生抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)来抵抗外界病原微生物的侵染,而果蝇Toll信号通路和Imd信号通路也分别与哺乳生物中的TLR通路和TNF-α信号通路同源,它们在免疫响应调控中具有相同的进化起源。因此,深入研究miRNA在果蝇Toll和Imd信号通路中的调控机制,不仅对清晰地阐明miRNA在果蝇免疫稳态中的功能与作用机制具有重要的意义,而且也能为进一步揭示miRNA在昆虫先天免疫以及人类先天免疫中的调控作用机制提供重要的启示。为此,本论文围绕miRNA如何调控果蝇Toll信号免疫响应这一科学问题,开展了一系列的研究,获得了以下的主要结果:1.利用实时荧光定量(qRT-PCR)对革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus,M.luteus)感染高表达miR-975/976/977果蝇后6个时间点的抗菌肽(Drosomycin,Drs)基因的表达进行了定量分析,发现感染后24h与48h的miR-975/976/977高表达果蝇的Drs显著下调;同时利用qRT-PCR方法进一步检测了基因缺陷型miR-975/976/977 KO果蝇Drs表达在12h、24h、48h呈显著上调,这些结果揭示miR-975/976/977能够负调控果蝇Toll信号免疫响应。2.为确定miR-975/976/977这一簇中是哪一种或哪几种miRNA调控果蝇Drs表达,我们进一步利用qRT-PCR分别检测了miR-975、miR-976、miR-977高表达果蝇感染后6个时间点体内Drs表达情况,结果发现只有miR-977与miR-975/976/977簇结果一致,都能够负调控果蝇Drs的表达。3.为了进一步揭示miR-977负调控Toll信号响应的机制,我们利用miRanda与TargetScan的程序对miR-977可能调控的靶基因进行预测,取交集后发现miRNA-977能够靶向果蝇Toll信号通路中的Toll、myd88和Dif。4.利用qRT-PCR检测果蝇体内Toll、myd88、Dif基因的表达水平,根据定量结果发现miR-977只能靶向Dif基因。5.基于miR-977的双荧光素酶报告系统分析结果,发现miR-977免疫调控功能主要是通过靶向果蝇Toll信号通路下游转录因子Dif的Dif-RA/RB/RD三个转录本来负调控Drs表达。总之,本文研究发现了miR-977是一种新的负调控因子参与果蝇Toll信号免疫响应的负调控,并且揭示了miR-977是通过调控Dif-RA/RB/RD三个转录本的表达,从而负调控果蝇Toll免疫响应;同时本文的研究也阐明了miRNA在革兰氏阳性细菌感染果蝇Toll介导的先天免疫应答中起着重要的调控作用。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q352
【图文】：

示意图,信号通路,果蝇,蛋白

ath domains 的 MyD88 蛋白，MyD88 蛋白上的 Death domains 招募 TuPelle 蛋白，这两种蛋白的也含有 Death domians 结构域。Pelle 蛋白上苏氨酸激酶结构域，可以将哺乳动物同源的 IkB 蛋白 Cactus 磷酸化，录因子 Dif 和 Dorsal 的结合，将 Dif 和 Dorsal 的 NLS（核定位信号。使这两种转录因子入核，启动下游抗菌肽的转录（如图 1.1 所示

信号通路,果蝇

31.2.1.2Imd 信号通路目前研究揭示，Imd信号通路与哺乳动物的TNFR通路高度同源（如图1.2所示）。图 1.2 果蝇 Imd 信号通路（左）与人类 TNFR 信号通路（右）[19]Figure 1.2 Imd pathway in Drosophila and TNFR pathway in human.果蝇的Imd通路主要是对革兰氏阴性（G-）菌起作用。在G-菌侵染下，果蝇模式识别蛋白(PGRP-LC) 识别并结合G-菌表面的二氨基庚二酸肽聚糖（DAP-PGN），形成一个由Imd组成的信号复合体，激活Imd 接头蛋白。其中Imd是含有死亡结构域的蛋白质与哺乳动物RIP1 同源，Dredd 是哺乳动物caspase-8的同源蛋白。[20-23]。Imd通路激活，Iap2、UEV1、Ubc13、Ubc5一起通过泛素化激活Dredd，活化后的Dredd会对Imd 进行剪切，去除30 个氨基酸的 N 末端片段

示意图,示意图,沉默复合体,特定功能

的双链 miRNA 中过客链剪切掉，另一条引导链被保成了成熟 miRNA 诱导沉默复合体（miRISC）[71, 72]。内切酶活性的 AGO1、AGO3、AGO4 蛋白通过结合形成了具有特定功能性的 miRISC,而被剪切的过客链解（如图 1.3 所示）[73]。

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