拟南芥组蛋白H3K4去甲基化酶JMJ17在干旱胁迫和脱落酸应答途径中的功能研究

发布时间：2020-07-19 18:55

【摘要】：气候变化正在加剧全球干旱,严重威胁着粮食安全。由于植物是着地固定生长,不能主动逃避环境危害,为了生存植物进化出复杂且精细的调控机制来减少干旱危害。因此解析植物的抗旱分子机制对于培育新的抗旱品种有重要的指导意义。组蛋白的修饰是生物表观遗传调控的一种重要方式,组蛋白的修饰改变了染色质的构型,进而影响基因转录。本研究发现拟南芥中的一个组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)去甲基化酶,JMJ17,在干旱胁迫和脱落酸(ABA)应答途径中行使重要功能。本研究分析了组蛋白的去甲基化在干旱胁迫和ABA应答中的作用,阐明了H3K4去甲基化酶JMJ17调控干旱胁迫和ABA应答的分子机制。本研究利用分子生物学、生物化学和生物信息分析等方法,系统地分析了组蛋白去甲基化酶JMJ17在干旱胁迫和ABA应答过程中的调控作用。主要的研究结果如下:(1)利用亚细胞定位和时空特异性表达分析,发现JMJ17定位于细胞核,并在拟南芥的根、胚轴、花等部位均有表达。(2)与野生型相比,jmj17突变体表现出抗旱表型和对ABA敏感表型。(3)利用体内、体外酶活实验,我们发现JMJ17有组蛋白去甲基化酶的活性,能够有效地降低H3K4me1/2/3水平。同时发现,JmjC中与亚铁离子结合的保守氨基酸对JMJ17的去甲基化酶活性是必需的。保守氨基酸位点发生突变的回补系材料(JMJ17[H79A/E81A]),其叶片失水率以及干旱后存活率均与jmj17-1突变体相近,说明JMJ17的去甲基化作用对植物干旱胁迫应答是必需的。(4)jmj17-1单突变体与野生型的表型无显著差异,而jmj17-1 jmj14-1 jmj16-1三突变体表现出更大的莲座叶以及更早的开花表型,说明JMJ17与JMJ14、JMJ16可能在拟南芥生长发育过程中存在着功能冗余。(5)利用ChIP-seq和RNA-seq分析,发现在干旱胁迫后,与野生型相比,jmj17突变体中部分胁迫应答基因的转录水平与H3K4me3水平均显著上升,说明在干旱胁迫下JMJ17能影响H3K4me3水平同时还影响基因的表达。(6)我们构建了jmj17-1 ost1-3双突变体,发现双突变体在干旱胁迫下表型与ost1-3表型一致,结合ChIP-qPCR分析结果,发现在干旱胁迫应答过程中OST1在JMJ17的遗传学下游行使功能。(7)我们构建了jmj17-1 abi5-7双突变体,发现在ABA介导的种子萌发及幼苗生长抑制过程中,双突变体表现出与abi5-7突变体相似的ABA低敏表型,结合ChIP-qPCR的结果表明:在ABA介导的种子萌发及幼苗生长抑制过程中,JMJ17调控ABI5位点的H3K4me3水平进而影响其表达。(8)利用免疫共沉淀、双分子荧光互补等实验,我们证实JMJ17在体内与WRKY40互作;对ABA处理后的材料进行RNA-seq分析,发现与野生型相比,jmj17和wrky40突变体中的差异表达基因有显著的重叠,同时在含有ABA的培养基上,双突变体和各单突变体的种子萌发和幼苗生长表型相近,暗示JMJ17和WRKY40在同一条途径中调控ABA应答。综上所述,本研究结果表明组蛋白去甲基化酶JMJ17,通过调控OST1,ABI5等胁迫应答基因的H3K4me3水平影响这些基因的表达,在干旱胁迫和ABA应答途径中行使负调控作用。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945.78
【图文】：

闭合模型,气孔

图 1-2ABA 诱导气孔闭合模型[23]Figure 1-2 Model ofABA-induced stomatal closure[23]示，气孔开放因子（Stomatalopeningfactor，OST1酶，又被称为 SnRK2.6（sucrosenonfermenting-1（）。OST1 能影响 ABA 诱导气孔闭合的速度，同时调控的作用[24,25]。在植物遭受干旱胁迫后，保卫细 PP2C 对 OST1 的抑制作用，活化的 OST1 会磷酸wanionchannel-associated1）是 OST1 的一个靶蛋阴离子通道蛋白。SLAC1 的磷酸化能导致其激活外流（Cl-/NO3-），引起钾离子的释放。另一个已知通道 KAT1（K+inward rectifying channels in A. tha KAT1 抑制其活性，这样阻止了 K+内流。OSTrespiratoryburstoxidasehomolog，RBOH）使其激gen species，ROS）的产生[25]。ROS 在 ABA 信号以激活质膜和液泡膜上的 Ca2+通道，使 Ca2+释放到

示意图,负调控,干旱胁迫,基因

21图 3-1 JMJ17 在干旱胁迫应答过程中的负调控作用Figure 3-1 JMJ17 plays negative roles in dehydration stress responses（A）JMJ17 基因示意图。外显子和内含子分别用黑色实框和黑线表示，三角形表示 T-DNA插入位置。（B）JMJ17 转录本的 RT-PCR 分析。利用特异引物进行半定量 RT-PCR 分析，18SrRNA 作为内参对照。（C）和（D）离体叶片失水速率的测量。取各基因型植株的地上部分放在相对湿度 30%的条件下，在不同时间点进行称重。（C）失水 3h 的表型，标尺为 2cm；（D）失水率的统计，数据为实验平均值±SD，实验重复 3 次。（E）和（F）干旱后存活率的测量。将土中生长 14 天植株干旱处理 14 天，复水 3 天后检测存活率。（E）干旱后植物的表型图片；（F）复水 3 天后植株存活率的统计。数据为实验平均值±SD，实验重复 5 次，**代表 P < 0.01，t 检验。随后我们利用 CRISPR/Cas9 方法得到了另两个突变体：jmj17-3 和 jmj17-4。CRISPR/Cas9 系统载体来自刘耀光老师的惠赠，Cas9 是由 YAO 基因（特异地在

突变体,位点,测序,终止密码子

胚囊、胚、胚乳和花粉中表达）启动子驱动[92]。利用 Sanger 测序方法，我们筛选到 jmj17-3 和 jmj17-4 的纯和突变体。jmj17-3 中在 ATG 下游 543bp 处有一个碱基的增加，导致了移码突变，最终在 JmjC 结构域中产生了终止密码子（终止密码子在 556-bp 到 558-bp）（图 3-2A 和附表 2）。同样在 jmj17-4 中，在 ATG 下游的 580 bp 处有一个碱基的缺失，导致了 646~648 bp 处提前形成终止密码子。为了排除 Cas9 基因的影响，我们通过筛选不抗潮霉素的植株，得到了不含 Cas9的 jmj17-3 和 jmj17-4 的纯和突变体（图 3-2 B）。我们发现 jmj17-3 和 jmj17-4 叶片失水速率慢于野生型。随后我们将 jmj17-3 或 jmj17-4 与 jmj17-1 杂交得到 F1代，[jmj17-1 x jmj17-3 (F1)或 jmj17-1 x jmj17-4 (F1)]，发现 F1 代的土中干旱存活率与 jmj17-3 和 jmj17-4 相似，即存活率明显高于野生型（图 3-2C,D）。说明 jmj17-3 和 jmj17-4 与 jmj17-1 是在同一基因发生的突变，JMJ17 缺失突变的拟南芥抗旱性显著提高。

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