基于split-GFP体内重组高通量筛选系统提高嗜热酯酶的可溶性表达及催化活力

发布时间：2020-07-22 00:30

【摘要】：嗜热酯酶是最具有应用潜力的绿色生物催化剂之一,因其具有耐热性、pH稳定性和有机溶剂耐受性等特点广泛应用于各个行业。前期从超嗜热菌Aquiex aeolicus VF5(风产液菌)基因组中筛选得到一种嗜热酯酶基因Aaeo1,实现了其在大肠杆菌系统(Escherichia coli)中的异源表达,发现其存在包涵体及催化活力低的问题。为了得到高效的嗜热酯酶,利用定向进化对其进行分子改造,通过两步高通量筛选法得到可溶性表达和催化活力同时提高的突变株并进行酶学性质研究。具体包括:(1)建立了易错PCR(error-prone PCR,epPCR)突变反应体系。确定最优条件:Mg~(2+)7 mmol·L~(-1),Mn~(2+)0.2 mmol·L~(-1),平均突变率为0.31%,满足构建文库要求;(2)建立了灵敏、快速、高效的两步高通量筛选法。以split-GFP为报告基因结合定向进化手段构建突变文库,与以全长增强型GFP(EGFP)为报告基因相比,有效地降低了筛选过程中的荧光背景和假阳性程度,阳性突变率从88%提高至95%。根据荧光强度与酶活力/蛋白浓度之间良好的线性关系,通过流式细胞分选仪从库容量不小于10~4的突变文库中初筛得到可溶性表达提高的突变株,对初筛目的菌株进行酶活力复筛;(3)筛选获得了可溶性表达和酶活力同时提高的突变株。通过两步高通量筛选得到了2株优势突变菌株EP1和EP2,分别含有4个氨基酸突变位点:I8V/I51V/F127I/E170D、V17G/H22R/K92N/I158K。可溶性蛋白含量是野生型的2倍左右,纯化后的突变酶EP1和EP2的比活力分别是野生型的3.14、3.2倍左右。通过定点突变筛选得到突变株I51V、E170D和I51V/E170D的粗酶活分别是野生型的2.35、2.46、4.5倍。对两个位点分别构建小型饱和突变文库,筛选后进行组合得到突变株I51L/E170D的酶活力是野生型的4.8倍左右。纯化后突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的比活力分别是野生型的6.86、10.01、14.86倍;(4)研究突变酶的一系列酶学性质。突变酶均在70 ~oC时测定最大酶活性,突变后仍保持嗜热性,且在高温条件下更稳定。突变酶的最适pH值均为8.0,且在微碱性环境下催化效果更佳。突变酶EP1和EP2的K_m值降低,说明突变酶对底物的亲和力增强,k_(cat)/K_m值分别是原始酶的2.42、2.35倍,因此催化活性增强。突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的K_m值提高,k_(cat)/K_m值分别是野生型Aaeo1的5.65、4.79、10.7倍,催化效率提高的主要原因可能是由于底物结合口袋的变化导致突变酶的催化能力的提高;(5)通过同源建模分析了Aaeo1突变体酶活提高的机制。蛋白质分子空间结构模拟显示,推测E170D突变改变了Aaeo1的口袋。第170位点与活性位点Asp163的距离约为8.9?,第51位点与Ser62之间仅由一个β-sheet连接,可能会通过长距离或短距离影响酶活力的变化。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55
【图文】：

信息选择,理性设计,嗜热,常温

目前关于耐热机制的提出大致可总结为：(1) 热稳定性是内在的[6]。通过比和常温菌的蛋白质氨基酸组成的比较，发现嗜热菌蛋白质中 Ala、Pro、Arg、均高于常温菌，而 Asn、Gln、Cys、Trp、Val、Ile 的含量显著低于常温菌；质的耐热性[7]。高温环境下的菌的 GC 百分比高，那么意味着解链所需的温度3) 蛋白高级结构的空间相互作用[8]，如非共价力等。嗜热蛋白酶离子结合位点离子(Ca2+、Mg2+等)起到促热稳定作用。随着基因工程的出现和迅速发展，从种筛选、分离纯化、酶学性质的研究到结构分析、催化机制、基因改造等方面究，开发了嗜热酯酶在其他方面的应用价值。嗜热酯酶的分子改造.1 理性和非理性蛋白质设计的区别蛋白质的改造可以分为理性设计和非理性设计，两者之间的不同主要集中在以面：(1) 非理性设计不需要掌握关于酶的结构和机制；(2) 理性设计适合二级结域的研究；(3) 非理性设计需要选择策略；(4) 理性设计无点突变偏好性。基于能的信息选择酶改造策略如图 1-1 所示：

流程图,思路,流程图,嗜热

实现其在大肠杆菌系统的异源表达，可溶性重组蛋白含量少且酶活力尚低，无法满足工业需求。因此，就如何改善嗜热酯酶在大肠杆菌中的可溶性表达和催化活性这两方面展开探究。论文研究思路按图 1-2 所示，通过优化的 epPCR 条件对嗜热酯酶基因任意位置插入突变，对于分子量为 24 KDa 的嗜热酯酶基因来说，具有高催化活力的目的转化子的获得，需要构建一个库容量不小于 104的突变文库。为了解决大部分嗜热酯酶表现为不可溶形式和酶活力低的问题，首先尝试了融合 EGFP 标签实现可视化分析，发现以 EGFP为报告基因会造成筛选过程中的假阳性。为了解决这一问题，基于 split-GFP 为报告基因并结合定向进化手段构建突变文库，通过流式细胞分选仪对文库进行快速、准确、高通量的初步筛选。根据荧光强度与酶活力/蛋白浓度之间的线性关系，通过测定全细胞荧光值获得可溶性表达水平显著提高的突变株，之后对初筛目的菌株进行酶活力的二次筛选。两步高通量筛选后得到可溶性表达水平和催化活力同时提高的优势菌株，然后利用定点突变分析突变位点，将优势突变位点进行点饱和突变建立小型文库以期得到酶活力进一步提高的菌株。对筛选得到的突变酶进行分离纯化后进行一系列酶学性质研究。最后，尝试通过同源建模分析突变酶活力提高的机制。

自组装,互补原理

图 2-1 split-GFP 体内自组装系统(a) GFP 分为 3 段: GFP1-9、GFP10 and GFP11; (b) split-GFP 之间的荧光互补原理；Fig.2-1 Split-GFP complementation assay in vivo. (a) The GFP was divided into 3 fragments; (b) Principleof the split-GFP complementation assay. The Aaeo1 gene was inserted between GFP10 and GFP11. Whenthe detector fragment GFP1-9 was added, GFP10-Aaeo1-11 could spontaneously assemble with GFP1-9fragment to form GFP with fluorescence emission.2.2.5 突变文库的构建以 pET28a-Aaeo1 为模板，通过引物 EPA11F 和 EPA11R，按照优化后的 epPCR 条件进行突变片段的扩增，上下游分别选择 BamHI 和 EcoRI 酶切位点(下划线所示)。EPA11F：5'-GCGGATCCATGCTGAAGAAC-3'EPA11R：5'-TTCGAATTCATACCCCTTTAAAATAGCTTT-3'50 μL epPCR 扩增体系：5 μL 10×epPCR buffer, 2.5 mmol·L-1dNTP, 100 mmol·L-1dCTP/dTTP, 20 mg·mL-1MgCl2, 1 mg·mL-1MnCl2, 20 μmol·L-1F/R, 2.5 U rTaq, 1 μL DNAddH2O 补齐至 50 μL。

【相似文献】