植物乳杆菌ZDY2013拮抗食源性致病蜡样芽孢杆菌的研究

发布时间：2020-07-21 22:48

【摘要】：乳酸菌被广泛应用于乳制品、传统发酵食品以及益生菌产品中,其与肠道菌群的相互作用是国内外研究的热点。在高效选育过程中乳酸菌与病原微生物竞争成为优势菌是应用的前提。本论文在构建产毒素蜡样芽孢杆菌识别方法的基础上,以植物乳杆菌ZDY2013为研究对象,从多角度探究其拮抗食源性致病蜡样芽孢杆菌的作用。全文分为六个章节。第一章绪论对食源致病菌的危害、蜡样芽孢杆菌的毒性、乳酸菌的功能及乳酸菌与食源致病菌的相互作用机制进行了分述,并对植物乳杆菌及其胞外多糖的功能进行了概述。第二章建立了识别复杂食品基质中产毒素蜡样芽孢杆菌的特异性方法。针对蜡样芽孢杆菌特异性序列设计了引物,并构建了选择性识别产呕吐毒素和产肠毒素蜡样芽孢杆菌的复合扩增体系;采用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品中细胞膜热破损细胞进行交联处理,再提取基因组DNA用于后续分析;采用多种食品基质、杂菌和死菌作为干扰因素考察复合扩增方法的准确性。结果表明,优化后的复合扩增体系能特异性识别产呕吐毒素和产肠毒素的蜡样芽孢杆菌,适用于淀粉类和乳制品等复杂食品基质的分析;食品基质中复杂菌群不影响该方法对目标DNA的信号获取,且无细胞活力的蜡样芽孢杆菌的DNA信号能够被有效消除;复杂食品基质中的产呕吐毒素菌株的最低检测限是10~3 cfu/g,而低浓度的产肠毒素蜡样芽孢杆菌(10~1 cfu/g)经过短暂增菌也能被特异性识别。第三章探究了植物乳杆菌ZDY2013拮抗产肠毒素蜡样芽孢杆菌的作用方式。利用体外试验确定产肠毒素蜡样芽孢杆菌ATCC14579和HN001受抑制与植物乳杆菌培养液pH的相关性;利用植物乳杆菌与产肠毒素蜡样芽孢杆菌在牛奶中共同培养,探索酸奶发酵中优势菌如何形成;利用小肠上皮细胞模型,研究植物乳杆菌通过不同的粘附定植方式,阻止产肠毒素蜡样芽孢杆菌粘附效果;利用细胞外乳酸脱氢酶活性指示产毒素蜡样芽孢杆菌毒素对细胞的毒害,以及从细胞相关基因应激过表达方面,研究植物乳杆菌对上皮细胞的保护作用。结果表明,产肠毒素蜡样芽孢杆菌在体外生长被抑制是植物乳杆菌产酸所致;在牛奶中共同发酵pH值不断降低,蜡样芽孢杆菌的数量在24 h后也随之下降,而植物乳杆菌不受pH降低的影响;植物乳杆菌能够通过排斥、竞争和替换的方式在小肠上皮细胞上抑制产毒素蜡样芽孢杆菌的粘附定植,且以竞争粘附位点为主;产毒素蜡样芽孢杆菌的培养上清具有破坏上皮细胞结构并诱导乳酸脱氢酶释放的毒性,植物乳杆菌能保护上皮细胞,应对产毒素蜡样芽孢杆菌培养上清导致的相关基因应激过表达。第四章探究了植物乳杆菌发酵奶干预产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠造成的毒副作用。第一组小鼠先灌胃产毒素蜡样芽孢杆菌再灌胃PBS缓冲液;第二组先灌胃植物乳杆菌发酵牛奶再灌胃产毒素蜡样芽孢杆菌;第三组先灌胃产毒素蜡样芽孢杆菌再灌胃植物乳杆菌发酵牛奶;第四组为对照组只灌胃PBS缓冲液。通过监测小鼠体重指数变化,确定产毒素蜡样芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵牛奶对小鼠的直接影响;通过测定小鼠血清中炎症因子的水平以及生理生化指标变化,探究产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠健康的干扰作用,以及灌胃植物乳杆菌发酵牛奶是否对其有改善作用;通过16S rDNA高通量测序,分析产毒素蜡样芽孢杆菌是否扰乱肠道菌群平衡,以及植物乳杆菌发酵牛奶是否有利于其恢复。结果表明,产毒素蜡样芽孢杆菌会导致小鼠体重增长放缓甚至降低,也会造成相关炎症因子水平异常;植物乳杆菌发酵牛奶能阻止产毒素蜡样芽孢杆菌导致全血中血小板数和血清中尿酸的升高,同时能够减轻盲肠病理组织的损伤程度;产毒素蜡样芽孢杆菌在不显著性改变小鼠肠道菌群整体结构的基础上,能导致部分菌群的丰度发生改变,而植物乳杆菌发酵牛奶能够缓和这种改变。第五章探究了植物乳杆菌胞外多糖拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌的特点。对胞外多糖进行提取、纯化,研究与其生物活性相关的分子量和单糖组分特征;采用磺化处理的方式对其进行性能改良,并表征其功能基团;比较胞外多糖及其衍生物对多种自由基的清除能力,研究磺化处理对胞外多糖生物学活性的改变;利用小肠上皮细胞为模型,探索产不同肠毒素类型(一种、两种或三种)蜡样芽孢杆菌对细胞活性的破坏,以及胞外多糖或者其衍生物的存在对细胞活性的保护作用。结果表明,植物乳杆菌胞外多糖的产量达429.4±30.0 mg/L、纯度为96.06%;空间排阻色谱洗脱曲线证明胞外多糖只有一个峰,分子量为5.17×10~4 Da;气相色谱图表明胞外多糖只由木糖和半乳糖组成,且半乳糖占总含量的98.3%;胞外多糖经过衍生化处理后,抗氧化活性明显提高,随之也增强抵抗产毒蜡样芽孢杆菌培养上清对小肠上皮细胞活性损伤的能力。第六章对植物乳杆菌拮抗食源性致病蜡样芽孢杆菌的生物学功能及其初步机制进行了总结,并对未来研究工作进行了展望。综上所述,本文探究了益生植物乳杆菌与食源性致病蜡样芽孢杆菌的相互作用,从体外、食品、细胞、小鼠以及代谢产物等层面解释了植物乳杆菌拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌的现象,加深了乳酸菌与病原微生物互相作用研究的认识,也为植物乳杆菌及其代谢产物在食品工业的开发应用提供了实验依据。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3
【图文】：

肠毒素,蜡样芽孢杆菌,毒素,毒性强度

图 1-1 呕吐毒素的具体结构[28]。Fig. 1-1 The structure of cereulide from Bacillus cereus芽孢杆菌能够表达大量的肠毒素和酶类从而引起腹泻疾病，不要因子[29]。非溶血性肠毒素（Nhe）、溶血性的肠毒素（Hbl白 K（CytK）被证实是蜡样芽孢杆菌引起腹泻型食物中毒的主 Hbl 由三种蛋白 B、L1和 L2组成，它们分别由 hblA、hblD 则包含三种蛋白 NheA、NheB 和 NheC，它们分别由 nheA、nhCytK 是 β 桶状结构的成孔毒素单一物质[29]。Hbl 和 Nhe 的分测定方法有关，而 CytK 分子量为 34 kDa，具体见表 1-1。值分蜡样芽孢杆菌能够分泌肠毒素，然而，导致腹泻疾病的蜡样有上述几种肠毒素，另外，这三种肠毒素的毒性强度也存在差表明 Nhe 是最强的致腹泻毒素[33]。表 1-1 Hbl、Nhe 蛋白的分子量大小[29; 34]。Table 1-1 The molecular weight (Mw) of Hbl and Nhe proteins

酸环境,芽孢杆菌,蜡样芽孢杆菌,细胞内

7图 1-2 一些芽孢杆菌（蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等）对细胞内外酸环境的适应性[46]。Fig. 1-2 The response of Bacilli (Bacillus cereus and B. subtilis) to the weak organic acid

益生菌,生物学特性

图 1-3 益生菌生物学特性[58]。Fig. 1-3 The physiological benefits of probiotics.1.2.2 乳酸菌在乳制品中的应用益生菌与人类生活息息相关，从婴幼儿所需的母乳、市场上受欢迎的酸奶、家庭中常见泡菜到益生菌保健品，益生菌在人类健康中发挥着不可替代的作用。目前，作为益生菌的乳酸菌在食品和保健品工业的全球市值超过 360 亿美元，且年增速达 15-20%；据中商产业研究院预测，中国乳酸菌产业规模在 2020 年将达到 850 亿元。乳酸菌在牛奶发酵产品中发挥着菌种特有的生物特性[59]，包括产生的乳酸或者抗菌物质提高奶制品的货架期，一些病原微生物（单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌等）能利用牛奶中比较丰富的生长所需营养物质，积累一些抑菌的细菌素，目前一些乳酸菌的细菌素已被成功应用于

【参考文献】