构巢曲霉中调控胞质分裂和无性产孢的重要蛋白PomA、PaxB和AcnA的功能研究

发布时间：2020-07-21 12:10

【摘要】：细胞分裂(cell division)是细胞生命活动的重要特征之一,主要包括细胞核分裂和胞质分裂(cytokinesis)两步。胞质分裂作为细胞分裂的最后一步,将一个母细胞分裂成两个子细胞。在哺乳动物细胞中,异常的胞质分裂可能会导致一系列疾病,甚至机体死亡。在酵母细胞中,异常的胞质分裂会导致形成无核或者多核的细胞。在丝状真菌中,胞质分裂对于产孢、产隔和菌丝生长都有十分重要的作用。胞质分裂主要是由肌动蛋白收缩环(contractile actin ring,CAR)收缩拉着细胞膜内陷使细胞缢裂成两个子细胞,在真菌细胞中还伴随着隔膜的形成。这一过程大致可以分为四步:选择分裂位点、肌动蛋白收缩环的组装、肌动蛋白收缩环收缩以及收缩完成后的去组装。前期研究发现,在模式丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中存在一条由一系列保守激酶组成的隔膜形成开始网络(Septation Initiation Network,SIN)正向调控胞质分裂过程。其中Sep H是SIN信号途径中的核心组分,对胞质分裂和无性产孢起着十分重要的作用。研究发现,当Sep H缺失时菌丝胞质分裂缺陷、不产隔膜和无性孢子,当过表达Sep H时菌丝过度产隔。但是目前关于胞质分裂调控的研究仍然不够清楚,人们对于胞质分裂的调控机制知之甚少。sep H1是一株温度敏感型突变株,在限制性温度42℃培养时Sep H失活。本实验室前期通过紫外诱变得到116株产隔和产孢恢复的突变菌株,表明存在其它调控因子参与胞质分裂的调控。因此,本研究以丝状模式真菌构巢曲霉为研究材料,基于以上突变体库筛选新的胞质分裂调控因子并对其调控机制展开研究,主要得到以下结论:1、蛋白激酶Pom A是sepH1的反向调节子。首先,用正向遗传学的方法寻找sepH1的反向调节子。通过菌落表型分析和显微镜观察筛选出产隔与产孢恢复的菌株,通过曲霉杂交验证突变菌株为非sep H回复突变。用二代测序技术和SNP分析发现突变株中蛋白激酶Pom A的活性位点发生突变。接下来,用反向遗传学的方法进行验证,构建sep H1和pom A双突变菌株,菌落表型分析以及显微镜观察显示sep H1和pom A双突变菌株相较于sep H1单突变菌株产隔与产孢都有恢复,表明Pom A是sep H1的反向调节子。2、Pom A通过负调控MAPK途径的活性反向调节Sep H。定量磷酸化蛋白质组学显示敲除Pom A后MAPK途径活性升高。Western blot显示,与野生型对比sep H1中MAPK活性明显降低,而Pom A突变菌株中MAPK活性升高,表明Sep H是MAPK途径的正调节子,而Pom A是负调节子。通过显微镜观察,盐逆境激活MAPK途径也能恢复sep H1隔膜与孢子的产生。表明Pom A通过和Sep H协同调控MAPK途径活性进而反向调节Sep H。3、Paxillin蛋白Pax B参与调控产隔与产孢。通过生物信息学分析,构巢曲霉中包含两个paxillin蛋白Pax A和Pax B。敲除Pax B后,菌落不产孢子,菌丝细胞不产隔膜,表明Pax B参与产隔与产孢的调控。4、AcnA和Pax B通过调控Actin环在分裂位点的组装而参与调控胞质分裂。通过GFP荧光标记和荧光显微镜观察,在Acn A和Pax B敲除菌株中,Actin不能在分裂位点组装成环状结构而造成胞质分裂缺陷。表明Acn A和Pax B是Actin环组装所必须的。综上所述,本文发现一个负向调节子Pom A和两个正向调节子AcnA和Pax B参与调控构巢曲霉的胞质分裂,并阐明了它们的调控机制,丰富和完善了胞质分裂调控网络,对细胞的胞质分裂活动有了新的认识。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q253
【图文】：

胞质分裂,物种

胞质分裂都是相对保守的 (图1.1)，大致可以分为四个关键步骤：一、选择胞质分裂位点，在接收到开始胞质分裂的信号后细胞中的地标蛋白 (landmarks protein) 会首先到胞质分裂位点定位并引导和招募其他参与胞质分裂的蛋白聚集并展开后续的胞质分裂活动；二、胞质分裂复合体的组装，当选择好胞质分裂位点后，胞质分裂相关蛋白陆续定位到分裂位点共同参与 Actin 收缩环的组装。三、Actin 环的收缩，当 Actin 环组装完成后，细胞中的调控信号将会启动 Actin 环的收缩。在哺乳动物细胞中收缩的Actin 环会牵拉着细胞膜的内陷最终将细胞缢裂成两个子细胞，从而完成胞质分裂。而在真菌细胞中，Actin 环为细胞膜的内陷提供拉力，同时在分裂位点会形成几丁质隔膜提供推力，在两种力的共同作用下完成胞质分裂。四、去组装，为了顺利进行接下来的生命活动，胞质分裂完成后组装在分裂位点的蛋白复合体中一部分蛋白转移到其他地方继续发挥功能，而另一些蛋白则会被降解回收利用[14]。图 1.1 不同物种中的胞质分裂[15]Fig.1.1 Cytokinesis in different model or

芽殖酵母,绿色,蛋白,胞质分裂

图 1.2 芽殖酵母中的 Septin 蛋白 (绿色)[35]Fig.1.2 Septins (green) in the cell cycle of S. cerevisiae Actin 环Actin 是肌动蛋白收缩环中最关键的组分，收缩的 Actin 环作为一个动力拉着细胞膜内陷最终完成胞质分裂 (图 1.3)。Actin 环的组装非常复杂，需多蛋白的相互作用才能形成一个完整有功能的 Actin 环。其中研究较多的是 Actin 环时需要的一类保守蛋白 formin。在裂殖酵母中 formin 蛋白为 Cdc在芽殖酵母中为 Bni1[39]，在构巢曲霉中它们的同源蛋白为 SepA[40-4rmin 蛋白的缺失都会导致细胞不能正常形成 Actin 环状结构而导致胞质分裂。除此之外，Actin 环的形成还需要很多蛋白的协助，比如说研究较多的 Pax白以及 Septin 蛋白[43]，在酵母中以及其他形成细胞壁的真菌细胞分裂过程

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图 1.3 后生动物以及芽殖酵母细胞中肌动蛋白环的形成[49]Fig.1.3 Actomyosin ring formation in budding yeast and metazoan cells1.4 真菌的胞质分裂1.4.1 真菌的概述不管是从微小生物的利用或者防治还是到哺乳动物组织器官发育或者疾病治疗等方面，胞质分裂作为十分重要的生命活动都具有较大的研究意义。但是由于哺乳动物细胞操作难度大和操作成本高等原因，让繁殖速度快、结构相较简单和具有遗传可操作性等优点的真菌成为研究胞质分裂很好的模式生物。常见的真菌主要可以分为三类：蕈菌、酵母菌以及霉菌 (丝状真菌)。而目前研究胞质分裂常用的模式真菌主要有三种，分别为芽殖酵母、裂殖酵母以及丝状真菌构巢曲霉。接下来将对这三种真菌的胞质分裂机制一一进行阐述。

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