水稻OsSAUR10的表达和功能研究及水稻胚芽特异表达基因的生物信息学分析

发布时间：2020-07-24 06:00

【摘要】：植物的生长起始于种子萌发,受生长素和基因的共同调控。生长素是植物中最早被发现并研究的激素,它在植物细胞、组织和器官的分化、生长及植物与环境间的信息交流中发挥着重要的调控作用。根据生长素对基因表达的诱导或抑制的速度,被生长素调节转录的基因可分为早期响应基因和晚期响应基因。生长素早期响应基因是生长素响应因子直接作用的一类基因,Small auxin-up RNA(SAUR)基因是已知的主要的早期基因之一,能够被生长素诱导,其表达量能在很短的时间内快速上调,进而调节植物的生长发育。因此对OsSAUR10的表达和功能研究对于揭示生长素早期响应的调控机制具有重要的意义;同时对胚芽萌发时期的全基因组内胚芽特异表达基因的筛选、鉴定和生信分析将有为进一步研究提供理论基础。本实验以水稻生长素早期响应基因OsSAUR10为研究对象,首先进行了基本的生物信息分析,研究了OsSAUR10的时空表达和亚细胞定位,同时通过农杆菌介导的水稻转基因技术获得OsSAUR10的CRISPR和超表达植株以进一步研究OsSAUR10的功能,同时还系统的对水稻胚芽特异表达基因进行了生物信息学分析,所获得的主要结果如下:1.水稻OsSAUR10编码一个由166个氨基酸组成的蛋白质,不含信号肽,存在1个跨膜结构域和3个CG岛。表达分析表明该基因在花药、幼穗、根和苗期的表达量较高,并且该基因的表达量在IAA、NOA、ABA、GA3诱导后显著上调。说明OsSAUR10在水稻生长旺盛的部位表达。2.构建35S::OsSAUR10:GFP载体,通过PEG4000转化水稻原生质体,并利用特异性的细胞膜染料Dil,将水稻原生质体的细胞膜染为红色,通过激光扫描共聚焦显微镜观察到GFP荧光与Dil荧光重合,说明OsSAUR10蛋白定位于细胞膜。3.构建OsSAUR10超表达载体和CRISPR载体,并通过农杆菌侵染水稻愈伤的方法获得转基因植株。结果表明T_1代OsSAUR10过量表达转基因植株苗期矮小、根系短。所获得CRISPR突变类型为OsSAUR10起始密码子后第192位到197位碱基缺失和第196位单碱基缺失两种缺失突变。CRISPR家系种子的萌发率、结实率、分蘖数都降低,且在苗期矮小。说明OsSAUR10正向调控水稻种子萌发和苗期生长,且超表达家系和CRISPR家系在苗期的表型相同可能是由于响应不同的激素途径导致的。4.进一步研究水稻中与生长素合成相关的OsYUCCA家族基因和与生长素极性运输相关的OsPIN家族基因在超表达植株和CRISPR植株中的表达量。结果表明OsSAUR10抑制OsYUCCA家族和OsPIN家族基因的表达。5.通过对芯片数据的筛选,鉴定到了88胚芽特异表达基因(plumule-specific genes,OsPluS),45个OsPluS的仅在胚芽中高表达,9个OsPluS在所有组织中的表达量都较高。启动子元件的分析显示,在启动子区域存在与胚发育,激素响应相关的顺式元件,如-300 element,ABRELATERD1、ABADESI1、LTRECOREATCOR15、CAREOSREP1、GAREAT、WRKY71OS等。6.OsPluS的GO/KEGG富集分析表明,OsPluS可能参与脂肪酸生物合成过程,OsPluS互作蛋白的GO/KEGG富集分析的结果表明,OsPluS可能参与了生长素和脱落酸的合成。说明OsPluS与水稻胚芽发育过程中脂肪酸的合成相关,并且可能通过激素响应调节水稻的胚芽发育。
【学位授予单位】：贵州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511;Q943.2
【图文】：

结构信息,三级结构,无规则

第三章结果与分析.1 OsSAUR10 的结构分析为了研究OsSAUR10的结构特征，我们对OsSAUR10的二级结构、三级结及结构域进行了分析。OsSAUR10基因全长1451bp，cDNA全长501bp，不含子，且3′UTR含有SAUR家族所具有的DLS元件，经SMART软件分析发现sSAUR10在第12到第112位氨基酸之间含有Auxin inducible结构域（图1 AsSAUR10的二级结构包含α螺旋和延伸链，但大多数结构为无规则卷曲（图1三级结构也可以看出，OsSAUR10蛋白的三级结构较为简单，以无规则卷曲（图1 C）。

花药,苗期,水稻,分裂活动

secondary structure information; B, the location of the auxin response domain in OsSAUR10; C, The tertiarystructure of the OsSAUR10 protein.3.2 OsSAUR10 在胚芽期、根和花药等组织中高表达为了探索 OsSAUR10 的表达模式，我们分别取了水稻 ZH11 在萌发后的不同时期、苗期、抽穗期的根、叶、小穗以及花药等组织进行 qRT-PCR（图 2）。结果显示 OsSAUR10 在苗期的表达具有周期性，基因在表达升高后马上又会降解，说明 OsSAUR10 在胚芽期有关键的作用，在胚芽期、根、穗期和花药中的表达量较高。GUS 染色的结果显示 OsSAUR10 在根和根毛中表达。以上结果暗示 OsSAUR10 在分裂活动旺盛的组织中高表达，在这些时期可能会影响水稻的发育。

序列,情况,起始密码子,材料

3.3 OsSAUR10 CRISPR 材料的构建及表型分析为了通过基因编辑获得 OsSAUR10 的敲除突变体进行功能研究，我们选取OsSAUR10 基因外显子上的 AGAAGGAGCGGTTCGCGGTG 序列作为 gDNA，通过重叠 PCR 的方法构建了 pCXUN 重组载体，转化粳稻 ZH11。对 T0代材料进行阳检，将发生编辑的材料进行加代培育。对 T0代的材料进行阳检和基因型鉴定可知，通过 CRISPR-Cas9 编辑的 OsSAUR10 获得了 2 种类型的突变，第 1种为 OsSAUR10 起始密码子后第 196 位单碱基缺失，第 2 种为起始密码子后第192 位到 197 位碱基缺失（图 3）。从测序结果可知，CRISPR 产生的两种编辑情况均为纯合突变，将这两个家系分别命名为 Cr10-6 和 Cr10-15 并选择它们进行后续研究。

【相似文献】