果蝇Kr-h1表达调控相关miRNA的筛选及对变态发育影响的研究

发布时间：2020-07-24 11:23

【摘要】：果蝇的变态发育主要由保幼激素(juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)协同调控,Kr-h1基因作为保幼激素的初级反应基因,在保幼激素信号传递中发挥至关重要的作用。而miRNAs作为一种长约22 nt的非编码小RNA,通过结合靶基因mRNA的特定位点,抑制mRNA翻译或诱导降解,从而参与调控人类及动植物的生长发育和细胞凋亡等重要生理活动。因此,本研究以黑腹果蝇为试验对象,研究在完全变态昆虫中靶向作用于Kr-h1基因的miRNA,并证明miRNA对果蝇发育的影响,为生物学防治蚊蝇提供理论基础和指导。本试验首先通过多个生物信息学预测网站对靶向果蝇Kr-h1基因的miRNA进行预测,最终锁定miR-927为可能靶向作用于Kr-h1基因的miRNA。接下来使用双荧光素酶报告系统验证miR-927和Kr-h1基因之间的识别位点,结果显示,miR-927 mimics和Kr-h1 3'UTR共转染与对照组相比,双荧光素比值(F/R)降低极显著(P0.01),而Kr-h1 3'UTR单个位点突变的双荧光素比值均显著低于野生型载体(P0.05),两个位点同时突变较野生型相比,则差异不显著(P0.05)。结果表明,在Kr-h1基因的3'UTR上存在miR-927成熟序列特异性结合的位点,miR-927和Kr-h1基因存在靶标关系,Kr-h1基因能被miR-927特异性结合。为了探究miR-927与Kr-h1基因在转录水平的调控关系,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测了在果蝇Kc细胞中将miR-927超表达后,Kr-h1基因的变化情况。qPCR结果显示,miR-927 mimics转染组较NC组相比,Kr-h1基因的表达量显著降低(P0.05)。结合虫体不同发育时期miR-927和Kr-h1基因的相对表达量,证明miR-927与Kr-h1在某些发育时期呈相互抑制关系。本研究分别在细胞水平和虫体水平,研究了miR-927同JH之间的关系:使用保幼激素类似物Methoprene对果蝇Kc细胞及果蝇白色预蛹期进行不同时间梯度处理,检测miR-927的表达差异。结果显示,JH在细胞水平及虫体上均能够抑制miR-927的表达(P0.05)。然后将虫体JH缺失,检测miR-927的表达情况,结果显示,JH缺失组miR-927的表达量较野生型相比显著升高(P0.05)。结果证明,JH在一定程度上对miR-927起到抑制作用。为了更好的研究JH及miR-927对果蝇生长发育的调控,本实验使用Methoprene处理白色预蛹期的果蝇腹部,观察了背部刚毛的表型。结果发现,Methoprene处理能够导致果蝇背部刚毛出现短刚毛、背部刚毛不能正常融合及出现斑块等表型,且果蝇不能正常孵化成虫。miR-927超表达虫体则不能正常预蛹,一般发育至若虫则不再发育,且虫体发育缓慢,个体变小,极少数果蝇会变成“小蛹”,但未能孵化成虫。结论:(1)dme-miR-927靶向作用于Kr-h1基因;(2)在果蝇Kc细胞及虫体中,miR-927能够对Kr-h1基因进行转录水平的调控,可以抑制Kr-h1基因mRNA的表达;(3)JH在细胞水平及虫体水平均能够抑制miR-927的表达;(4)JH及miR-927均对果蝇的生长发育起到重要的调控作用。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q344
【图文】：

示意图,生成过程,示意图

ute 蛋白（Ago 蛋白）中后，两条链中一条链（导向链 guid中，形成可发挥作用的 RNA 诱导沉默复合体（miRNA-inC），而另一条链（过客链 passenger strand）则会排出复合物前并无明确报道（图 1-1[8]）。当然，在植物和动物中，mi：前体茎环结构及成熟过程。NAs 通过碱基互补配对与靶标 mRNA 的 UTR 区域（3'UTR对靶标 mRNA 剪切降解、抑制翻译以及染色体重塑（甲基化补时，就会切割靶 mRNA，这种作用方式常见于植物中；当时，通常只会抑制翻译而不影响 mRNA 的稳定性，这种方式少见；当同时具有以上两种作用模式时，称为结合抑制。mi可在非编码单元，又可在编码单元；既可在内含子区域，又iRNA 在基因组中和表达模式中成簇排列。

交叉分析,预测结果

miR-9388 0.779658421 miR析r-h1 的 miRNA 结果进行汇总（图 2-1）。由图 2-1 可知，microT-CDS、TargetS 个，分别是 miR-8、miR-277、miR-92

序列,靶基因,功能分析,生物调节

合位点分析 Targetscan 网站预测对 miR-927 和 Kr-h1 基因向序列主要为：AUUCUAA 和 AUUCUAAA信息学分析最大的 miR-927 进行靶基因预测，得到 121 17 个参与生物学过程的靶基因（图 2-2）。mi及生物调节过程。

【相似文献】