异常球菌角蛋白酶的异源表达和羽毛降解特性研究

发布时间：2020-07-24 21:25

【摘要】：角蛋白(Keratin)是一类广泛存在于自然界的非营养型硬蛋白,主要分布在动物的皮毛、蹄甲部位,结构中含有大量氢键、半胱氨酸构成的二硫键,二硫键相互作用形成致密的角蛋白结构使其难以被降解利用。角蛋白酶(Keratianse)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类,它能破坏羽毛角蛋白致密的结构达到降解的目的。为了更好的利用角蛋白和开发角蛋白酶基因本研究从戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)I-0和耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1中鉴定了三个角蛋白酶基因,分别命名为Kerdg1(DGO_RS02895)、Kerdg2(DGO_RS03965)、Kerdr(A2G07_RS01950),并在大肠杆菌中进行了异源表达和羽毛降解特性研究。主要结果如下:1、为了研究这三个基因,分析其序列结构发现Kerdg1由1239碱基组成可编码412个氨基酸残基,分子量为:41.1 kDa;Kerdg2由1599碱基组成编码532个氨基酸残基,分子量为:53.78 kDa;Kerdr由1599碱基组成编码532个氨基酸残基,分子量为:53.39kDa。序列比对发现KerDG1、KerDG2、KerDR蛋白含有跨膜结构和前导肽。结构中信号肽(The signal peptide)、N端前肽(N-terminal pro-peptide)、成熟蛋白区(mature protease)、C端尾巴(C-terminal pro-peptide)这四个部分与peptidases_s8_s53家族蛋白相似,此外成熟蛋白区都有3个主要的氨基酸残基(Asp、His、Ser)与已知的芽孢杆菌角蛋白酶(KerA)一致,确认三个基因是角蛋白基因。2、将这3个角蛋白基因分别连接到pET22b载体中,并转化到表达宿主BL21进行原核表达。对重组菌株进行降解能力分析,结果显示重组菌株对羽毛的降解作用明显。对重组菌株作用于羽毛后的产物进行检测,结果显示降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。3、将重组菌株诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示在菌液中、菌体上清中均能获得目的蛋白。对角蛋白酶酶学性质进行研究发现KerDG1最适pH和温度是5.0和60℃,酶活3.5 U/mL。KerDG2的最适pH和温度是8.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。KerDR的最适pH和温度是7.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。耐受性实验表明角蛋白酶能耐受一定的温度和pH。同时,还发现酶对金属离子和化学试剂也有一定的耐受性。
【学位授予单位】：西南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X705;X172
【图文】：

2 kerdg1、kerdg2、kerdr 角蛋白酶的生物信息分析结构主要分四个部分（图 2-2 已用黑箭头标出）：信号肽 The signal peptide (pre)，N 端前肽 N-terminal pro-peptide ，成熟 蛋白区 mature protease，C 端尾巴 C-terminalpro-peptide (C-pro)[76]5。成熟蛋白区（图 2-2 红色括号内）有 3 个活性位点氨基酸残基分别是 171 位的天冬氨酸残基、203 位的组氨酸残基、358 位的丝氨酸残基。氨基酸序列预测图表明该蛋白前端有一段序列形成前导肽，跨膜结构分析结果还显示该蛋白存在跨膜结构。

建及鉴定菌属角蛋白酶功能，本研究对耐辐射异常球耐辐射异常球菌含有 1 个角蛋白酶基因（k因（kerdg1、kerdg2）。根据基因序列设计特0 基因组中克隆出角蛋白酶基因，电泳结果 kerdr 条带单一，与理论分子量一致。回收酶切kerdg1、kerdr 的 PCR 产物和 pET 22b 表rdg2 的 PCR 产物和 pET-22b 表达载体并进行过夜。连接产物转化大肠杆菌 BL21 (DE3)的 LB 平板培养后进行筛选。挑取单菌落进 2~5 中均有目的基因。提取重组菌株的质粒进因均已成功插入载体。验证正确后送北京擎核表达载体 pET22b-kerdg1、pET22b-kerdg2菌株加入 70 %甘油（终浓度为 10-20%）于图如图 3-4。

图 3-2 菌落 PCR 验证结果Fig.3-2 Results of PCR validation colonies：Trans2K PlansⅡmarker；1~6：分别是 pET22b-kerdg1 单菌落 1~6；7：阴性。b：M：Trans2K PlansⅡmarker；1~5：分别是 pET22b-kerA 单菌落 1~5；6：照；8：空白。c：M：Trans2K PlansⅡmarker；1~6：分别是 pET22b-kerdg2 单照；8：阳性对照 d：M：Trans2K PlansⅡmarker；1：阳性对照；2~6：分别是 pE5；7：空白；8：阴性对照。:Trans2K PlansⅡmarker；1~6: pET22b-kerdg1 colony 1~6；7: negative control；: M:Trans2K PlansⅡmarker；1~5: pET22b-kerA colony 1~5；6: negative control；8: blank space. c: M:Trans2K PlansⅡmarker；1~6: pET22b-kerdg2 colony 1~6；: positive control. d: M:Trans2K PlansⅡmarker；2: positive control；2~6: pET22b-ank space；8: negative control.20001000

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本文编号：2769412