黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的克隆及抗逆功能分析

发布时间：2020-07-25 14:03

【摘要】：黄瓜是一种重要的具有很高经济价值的作物,由于在农业生产中经常遭受各种胁迫,使得黄瓜的正常生长受到阻碍,从而造成产量减产。提高黄瓜的抗逆能力,对黄瓜的增产、提高经济效益等都有着十分重要的作用和意义。我们以黄瓜全基因组测序为基础,对黄瓜金属硫蛋白基因家族进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR分析了黄瓜金属硫蛋白基因在胁迫下的表达量;通过RT-PCR克隆了CsMT4基因;通过进行酶切、连接以及转化,成功构建了pET32a-CsMT4表达载体,并通过原核表达系统对CsMT4基因进行抗逆性功能分析。主要结果如下:1.预测了黄瓜金属硫蛋白基因家族成员。黄瓜中共有3个金属硫蛋白基因,根据它们在染色体上的具体不同的位置,将它们分别命名为:CsMT2、CsMT3、CsMT4。进化分析表明,黄瓜CsMT3与水稻OsMT3a和OsMT3b以及拟南芥AtMT3聚为一类,但亲缘关系较远,同源性不高;黄瓜CsMT4与拟南芥AtMT2a和AtMT4b以及水稻OsMT4,但亲缘关系也比较远,同源性不高,CsMT2与水稻OsMT1d和OsMT2c聚为一类,亲缘关系比较近,同源性高。2.分析表明,黄瓜金属硫蛋白基因的表达具有明显的组织特异性:CsMT2在各个组织都表达,在茎、叶、花中的表达量很高;CsMT3不在根中表达,在茎中的表达量不是很高,在其它组织中表达量都很高;CsMT4在茎和花中不表达,在根的表达量比较低,在叶和果中的表达量较高。3.荧光定量PCR表达量分析结果表明,非生物胁迫(PEG、ABA和NaCl)的胁迫下,使用不同的胁迫方法处理,在不同程度上对CsMT4的表达都具有促进作用。4.通过RT-PCR克隆了黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4,成功构建了pET32a-CsMT4表达载体,并且在BL21中高效表达。5.抗逆性分析结果表明,原核表达的黄瓜金属硫蛋白CsMT4能够有效的提高大肠杆菌抗逆性。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S642.2;Q943.2
【图文】：

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第二章黄瓜金属硫蛋白基因的生物信息学分析2.2.4 黄瓜与其他物种金属硫蛋白 CsMT 的多序列比对及进化树构建采用 Clustal X 软件对金属硫蛋白 3 个黄瓜成员、7 个拟南芥成员和 9 个大豆成员进行序列多重比对（图 2-2），发现这 19 个脱水素蛋白都有金属硫蛋白的特征结构域-C 片段，并且高度保守。然而，不同类型金属硫蛋白 C 片段的数量及组成略有不同。类型 2 金属硫蛋白在 N-端和 C-端均含 C 片段，共 14 个 Cys 氨基酸残基（GmMT2b除外，图 2-2A），类型 3 金属硫蛋白在 N-端和 C-端也各有 1 个保守的 C 片段，但其Cys 氨基酸残基数分别只有 4 个和 6 个（图 2-2B），类型 4 金属硫蛋白却有 3 个保守的 C 片段（图 2-2C）。为进一步分析黄瓜金属硫蛋白与其它物种间的进化关系，以金属硫蛋白 3 个黄瓜成员、7 个拟南芥成员和 9 个大豆成员进行系统进化树构建。如图 2-3 所示，这 19个金属硫蛋白被分为 4 大类，黄瓜的 3 个金属硫蛋白 CsMT2、CsMT3、CsMT4 分别归属于 Type 2、Type 3 和 Type 4。

示意图,黄瓜,系统进化树,拟南芥

图 2-3 黄瓜、拟南芥和大豆的系统进化树gure 2-3 The phylogenetic tree of MT proteins in cucumber, Arabidopsis and soyb5 黄瓜金属硫蛋白的基序分布MEME 在线工具分析结果表明（表 2-5 和图 2-4），搜索的 10 个 motifs 当 1 个 motif (motif1)保守基序属 3 个黄瓜金属硫蛋白 CsMT2-CsMT4 所共有2 蛋白有 7 个 motifs，缺少 motif 3、motif 7 和 motif 8，CsMT3 和 CsMT4 蛋数均为 6 个 motifs（图 2-5）。图 2-4 黄瓜金属硫蛋白的基序 I 示意图

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图 2-3 黄瓜、拟南芥和大豆的系统进化树ylogenetic tree of MT proteins in cucumber, Arab白的基序分布具分析结果表明（表 2-5 和图 2-4），搜索的otif1)保守基序属 3 个黄瓜金属硫蛋白 CsMT2otifs，缺少 motif 3、motif 7 和 motif 8，CsMtifs（图 2-5）。

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