SrfABC复合毒素酶活性组分及其作用机理研究

发布时间：2020-07-26 11:23

【摘要】：致病杆菌属(Xenorhabdus sp.)是一类与斯氏线虫(Steinernema sp.)互惠共生的昆虫病原共生菌,能够分泌多种杀虫、抑菌和抗肿瘤的活性代谢产物,干扰宿主的免疫反应,导致昆虫宿主死亡。课题组在前期研究中,通过对X.stockiae HN_xs01菌株进行Fosmid基因组文库的构建,从中筛选出复合毒素SrfABC,对昆虫细胞和肿瘤细胞均具有明显毒性,并且发现三组分蛋白之间具有相互作用。本文对SrfABC复合毒素各组分的活性及其作用机理进行了研究,为该类毒素在致病杆菌对昆虫致病及抗肿瘤活性中的功能奠定了基础。本研究利用GST标签单独表达载体在大肠杆菌中表达SrfA、SrfB、SrfC蛋白,通过生测实验发现SrfA、SrfB、SrfC蛋白对棉铃虫均具有注射毒性,且三者混合时毒性最大。我们以枞色卷蛾中肠细胞系CF-203/2.5和人宫颈癌细胞系HeLa为作用靶标,利用倒置显微镜和MTT法发现SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能导致肿瘤细胞和昆虫细胞皱缩死亡,具有明显细胞毒性,且三者混合作用时毒性最大。通过Hoechst/PI双染和流式细胞仪检测发现SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能破坏CF-203/2.5细胞的细胞膜完整性,造成细胞凋亡,且三者混合作用时对细胞膜完整性破坏最大,凋亡率最高,并且三种蛋白均能将细胞周期阻滞在G2/M期。接下来,我们对SrfABC毒素各组分在细胞中的定位进行了研究。免疫荧光结果显示:CF203细胞中,SrfA、SrfB、SrfC蛋白单独或混合作用,均集中分布在细胞质;在HeLa细胞中,SrfA蛋白集中分布在细胞质,SrfB蛋白集中分布在细胞核,SrfC蛋白单独作用时分布在细胞质,混合作用时从细胞质转移至细胞核。通过Western blot验证了SrfA、SrfB、SrfC蛋白单独或混合作用,均能较高效率的、主动进入昆虫细胞和肿瘤细胞。为了研究SrfABC毒素各组分的作用机制,我们将SrfA,SrfB,SrfC分别转染至肿瘤细胞HeLa和昆虫细胞Sf9中。实验表明:SrfA,SrfB,SrfC蛋白均在HeLa细胞中成功表达;利用免疫沉淀及质谱技术筛选出其结合蛋白主要为骨架蛋白;Western Blot检测显示:SrfA蛋白转染进HeLa细胞后,除了目的条带外,还检测到分子量大于SrfA蛋白的条带,推测是SrfA蛋白在肿瘤细胞中的表达发生翻译后修饰,通过定点突变和糖苷酶处理,初步排除了糖基化修饰的可能性。本文探究了SrfABC毒素对人肿瘤细胞和昆虫细胞的细胞毒性,探明各组分的定位。初步分析了三元复合毒素的酶活性组分,初步研究了SrfABC类毒素在细胞内发挥毒性的作用机理,为该类毒素在致病杆菌对病原微生物抵抗宿主防御、毒力发挥及宿主定殖中的研究提供理论依据。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93
【图文】：

硕士学位论文24图3-1 SrfA蛋白电泳检测Fig 3-1 SDS-PAGE of SrfA ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脱液第三章 结果和分析3.1 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白的纯化将诱导表达后的三种蛋白质上清用 0.22 μm 滤膜过滤，用 10 倍柱体积的清洗缓冲液清洗 GST 琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液 5 mL，封闭底部，4℃结合 6 h，加入 5 倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入 2 倍柱体 Elution buffer 洗脱，收集蛋白，重复洗脱三次，收集洗脱液，进行 SDS-PAGE检测。纯化结果得到纯度较高的 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白（图 3-1、图 3-2、图3-3），并于-80℃保存备用。图3-2 SrfB

加入 5 倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入 2 倍柱体 Elution buffer 洗脱，收集蛋白，重复洗脱三次，收集洗脱液，进行 SDS-PAGE检测。纯化结果得到纯度较高的 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白（图 3-1、图 3-2、图3-3），并于-80℃保存备用。图3-2 SrfB蛋白电泳检测Fig 3-2 SDS-PAGE of SrfB ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脱液图3-3 SrfC蛋白电泳检测Fig 3-3 SDS-PAGE of the SrfC ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脱液

硕士学位论文以检测到明显蛋白条带，符合预计 113 kDa 的 SrfB 蛋白，SrfB，SrfA＋SrfB，SrfB＋SrfC，SrfA＋SrfB＋SrfC 与细胞孵育后的样品在 100-150 kDa 之间均可以检测到明显蛋白条带，符合预计 101 kDa 的 SrfC 蛋白。说明 SrfA，SrfB，SrfC 蛋白不论单独还是混合与细胞孵育，都可较高效率地，主动进入细胞。A B

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本文编号：2770698