拟南芥WD40家族蛋白TAWD在抵御高温胁迫中的功能研究

发布时间：2020-07-26 13:42

【摘要】：前期本实验室建立了基于拟南芥热诱导基因HSP18.2启动子驱动的萤火虫萤光素酶(HSP18.2:LUC)活性变化的突变体筛选方法,筛选得到高温下萤光增强的突变体tawd(Thermotolerance Associated WD40 repeat protein)。该突变体在高温处理后与野生型相比表现出高萤光素酶活性和对高温敏感。用图位克隆的方法克隆到了突变基因TAWD。该基因编码一个含WD40重复序列结构域(WD40 repeat protein,WDR)的蛋白,在本文中命名为TAWD,它在拟南芥各组织中组成型表达。WD40蛋白家族成员作为生物大分子相互作用的支架蛋白,在真核生物中广泛存在,在拟南芥中参与植物的生长和发育过程,被认为是发育和胁迫信号传递过程中的关键调控因子。本文通过耐热实验发现tawd的基础耐热性和获得性耐热能力与野生型相比减弱了。亚细胞定位发现TAWD主要分布在细胞核中,在细胞中的分布不受高温的影响。虽然正常培养条件下TAWD在野生型中表达量较低并受高温抑制,但通过免疫印迹(Western Blot)定量实验发现高温条件下TAWD的翻译水平与正常培养温度下的相比逐渐上调。热胁迫条件下,大多数热激响应(HSR)基因,如热激转录因子(HSFs)、热激蛋白(HSPs)等在tawd中的转录水平和野生型中的相比下调了。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)技术检测到TAWD与HSP89.1的启动子区结合。这些结果说明TAWD是植物耐热所必需的,在参与HSR基因表达调控过程中主要起正调控作用。通过RNA免疫共沉淀(RIP)技术检测到TAWD与HSP18.和HSP101的mRNA有结合,如前述,高温胁迫下HSP18.2,HSP101的转录水平在tawd中与在野生型相比下调了,推测TAWD可能参与维持mRNA稳定性。另外,受到热胁迫后,tawd中HSFA7a,HSFAb和HSFB1等HSFs基因mRNA的内含子保留增加了,这说明TAWD可能参与调控mRNA的可变剪接。最后,我们通过免疫沉淀和质谱联用的技术鉴定到TAWD与HSP70-1、HSP90.2等蛋白相互作用,前人研究显示拟南芥HSP70-1与辅助分子伴侣BAG4有相互作用。因此,我们进一步利用双分子萤光素酶的互补(Bimolecular Luciferase complementation,BiLC)实验和免疫共沉淀(Co-IP)技术分析了它们的互作,但没有检测到TAWD与HSP70-1、BAG4、HSP90.2等的直接相互作用。我们还创建了tawd、hsp70-1、bag4的多突变体材料,分析它们的LUC活性变化发现tawd/hsp70-1、tawdbag4、tawd/hsp70-1/bag4双突变体和三突变体的LUC活性表现出和tawd类似的变化,在高温胁迫下升高;耐热分析的结果显示,tawdhsp70-1和tawd/bag4与tawd相比在高温胁迫后的存活率上升了,而tawd/hsp70-1/bag4三突变体的耐热性比野生型更强。这些结果说明TAWD、HSP70-1和BAG4共同参与调控植物的耐热性。综上所述,TAWD可能作为一个热激响应的信号整合因子,在参与植物耐热性的调控过程中起着非常重要的作用。首先,TAWD参与调控HSR基因的表达,通过直接与HSP89.1启动子区域的顺式元件结合调控它的转录;其次TAWD可能参与维持HSR基因的mRNA稳定性和调控RNA的可变剪接,高温胁迫下,在tawd中检测到HSP18.2和HSPl01表达下调和RIP检测到TAWD与HSP18.2和HSP101的mRNA结合,同时热胁迫下HSFA2、HSFA7a等HSFs在tawd中出现内含子保留增加的剪接变化;最后,TAWD、HSP70-1和BAG4共同参与调控植物的耐热性,同时敲除TAWD、HSP70-1和BAG4可显著提高植物的耐热性。TAWD可能通过调控HSR基因的表达,与HSP70-1和BAG4—起参与调节植物的耐热性,提高植物在高温环境下的适应能力。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2
【图文】：

１．２热激转录因子及其功能逡逑以拟南芥为例，根据所含结构域的不同将其２１个ＨＳＦ基因所编码的蛋白分、Ｂ和０３类［１１’１８］。ＨＳＦＡｓ被认为是热诱导基因激活的主要调节因子；ＨＳＦＢｓ热诱导的转录激活功能，但有正常的ＤＮＡ结合功能，可能辅助ＨＳＦＡｓ起调节，ＨＳＦＣｓ的功能暂时不清楚＾＾’＾＇耶尺基因的启动子区域有一个保守的元件（Ｈｅａｔ邋Ｓｔｒｅｓｓ邋Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＳＥ）：邋５’－ＡＧＡＡｎｎＴＴＣＴ－３’，ＨＳＦｓ邋可以识别这种邋ＨＳＥＳＦＡｌｓ被预测直接参与重要的热激转录因子儿份为２、份仰的表达［２＼ＨＳＦＡｌａ在番茄中组成型表达，调控／／５７Ｍ和好＾５７的表达［２１］。逡逑ＳＦＡ２和ＨＳＦＡｌａ功能相似［２２］，但ＨＳＦＡ２只在受到胁迫时候表达，在拟南芥中达ＨＳＦＡ２可以提高其耐热性［１１］，也有研究发现ＨＳＦＡ２还参与盐胁迫［２３］和氧化［２４］。所以ＨＳＦＡ２是一个植物逆境胁迫响应与应答的关键调节因子。ＨＳＦｓ受上因的调控，例如拟南芥ＤＲＥＢ２Ｃ通过激活的表达进而调控植物的耐热性［２５胁迫条件下，拟南芥ＲＣＦ２与ＮＡＣ０１９结合使ＮＡＣ０１９去磷酸化后其功能被激活，逡逑ＮＡＣ０１９直接与启动子区域结合正向调控／／５及７６、等的表达［２６］

Ａ：正常培养条件下的幼苗作为对照；Ｂ，Ｄ：基础性耐热实验，在４２°Ｃ分别处理３小时（Ｂ）逡逑和６小时（Ｄ），然后在正常培养条件恢复培养５天后的状态和存活率统计分析；Ｃ，Ｅ：获得性逡逑耐热实验，先在３８°Ｃ处理１小时后正常培养温度恢复２小时，接着分别在４２°Ｃ处理３小时（Ｃ）逡逑和６小时（Ｅ），恢复５天后的状态和存活率。所有实验都至少有３次独立生物学重复，并得到逡逑一样的结果，选取其中一次的结果在此展示。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１．邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｗｄ．邋ｕｎｄｅｒ邋ｈｅａｔ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｕｎｄｅｒ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；邋Ｂ，邋Ｄ：邋Ｂａｓａｌ邋ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ邋ａｓｓａｙｓ，邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ逡逑１８逡逑

Ａ：邋５天大的幼苗的根毛细胞和下胚轴细胞在荧光显微镜下的观察情况；Ｂ：邋５天大别在３８°Ｃ和４２°Ｃ处理１小时后在叶表皮细胞的亚细胞定位情况。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２．邋Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＴＡＷＤ－ＹＦＰ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．逡逑Ａ：邋Ｒｏｏｔ邋ｈａｉｒ邋ａｎｄ邋ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ邋ｂｙ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｒｏｓｃｏｐｅ；邋Ｂ：邋Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｌｅａｆ邋ｅｐｉｄｅｒｍａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋0Ｃ邋ａｎｄ邋４２邋0Ｃ邋ｆｏｒ邋１邋ｈｏｕｒ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑３．２邋ＴＡＷＤ参与调控基因表达逡逑３．２．１逦突变导致ＬＵＣ活性增加逡逑野生型和中含报告系统，热激后中ＬＵＣ活性被激野生型被抑制。：ＷｆＦＤ基因发生突变后为什么会导致ＬＵＣ活性增强我们不清是我们进行了邋ＲＴ－ＰＣＲ和ｑＲＴ－ＰＣＲ实验。分别将２周大的幼苗在３８°Ｃ处理０，１小时，３小时后提取ＲＮＡ后进行ＲＴ－ＰＣＲ，利用半定量和ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法了逦ＺＵＣ和ＭＦＺ）基因在野生型、ｔｏＷ和互补材料ｔｏｍ／－ｃｏ／ｗ中转录上的变化，结果如下：逡逑，ｔｏｗｄＺＣ／Ｃ，

【参考文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 刘爱丽;采用酵母双杂交技术筛选热激反应相关剪接因子的互作蛋白[D];华中师范大学;2016年

2 田亚苗;拟南芥热激基因表达调控因子的基因克隆及初步功能分析[D];华中师范大学;2015年

本文编号：2770832