snx-3（tm1595）线虫肠细胞中自噬小体积累的机制研究

发布时间：2020-07-27 11:08

【摘要】：自噬(autophagy)是一类进化上保守的细胞内降解过程,主要是将细胞内老化或多余的细胞成份运送到溶酶体中进行降解。具有双层膜结构的自噬小体包裹着自噬底物,与内吞小体及溶酶体融合或者直接与溶酶体融合,随后自噬小体包裹的自噬底物被溶酶体中的水解酶降解,降解过程释放的能量以及降解后产生的氨基酸小分子可以被细胞重新利用。自噬在维持细胞内稳态、生长发育、免疫能力、分化重建中也具有重要的作用。分选蛋白(SNXs)能够在胞内完成转运蛋白的分拣,进而对内吞体进行精细调控。分选连接蛋白3(sorting nexin 3,SNX3)是SNX~(PX)类蛋白的一个成员,目前研究的最多的功能是SNX3调控细胞内蛋白转运,内吞体成熟与分选等,SNX3在自噬过程中的作用还没有被很好的探究。有研究表明线虫(C.elegans)体内snx-3基因突变后会造成一系列发育障碍。我们利用成像研究观察到snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体相关结构的标记蛋白LGG-1蛋白出现明显积累,生化结果也表明GFP::LGG-1含量增多。ATG-13、BEC-1和ATG-7在自噬小体的形成过程中发挥着重要作用,我们利用成像技术观察到snx-3分别与atg-13,bec-1以及atg-7双突变的线虫肠细胞中LGG-1的含量明显减少,表明snx-3(tm1595)线虫肠细胞中LGG-1增多是由于自噬活动导致。因此我们以秀丽线虫为模式生物,探究了snx-3(tm1595)线虫肠细胞中LGG-1增多的原因。我们首先想知道snx-3(tm1595)线虫体内自噬通量(autophagic flux)的水平,自噬通量可以衡量细胞降解活性。使用mCherry::GFP::LGG-1标记区分自噬小体与自噬溶酶体,我们观察到snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体含量明显升高,自噬溶酶体含量没有明显变化,推测snx-3(tm1595)线虫体内自噬通量下降。自噬底物W07G4.5聚集体增多证明snx-3(tm1595)线虫体内自噬通量下降。我们分别对snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体的生成、自噬小体与溶酶体的融合和自噬小体在溶酶体中的降解三个阶段进行检测。干扰CUP-5的表达或者使用Baf A1处理破坏溶酶体的功能后,snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体没有进一步升高,而且snx-3突变后daf-2(e1370)线虫体内LGG-1的含量升高,表明SNX-3不参与自噬早期阶段中自噬小体的生成,snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体没有被诱导增多。Baf A1处理后不影响snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体和自噬溶酶体的分布,表明snx-3(tm1595)线虫体内自噬小体与溶酶体的融合或者自噬小体在溶酶体中的降解存在障碍。通过统计比较与溶酶体融合的自噬小体所占的比例,我们发现snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体与溶酶体融合减慢。LysoTracker可以检测并反映溶酶体的酸性情况和功能强弱,使用LysoTracker标记溶酶体我们观察到snx-3(tm1595)线虫肠细胞中溶酶体功能正常。另外,通过饥饿诱导自噬观察LGG-1标记的自噬结构蛋白的降解,我们发现snx-3(tm1595)线虫肠细胞中自噬小体在溶酶体中的降解正常。总之,本论文工作证明了snx-3(tm1595)线虫体内自噬通量降低,降解活性下降。snx-3(tm1595)线虫肠细胞中积累的LGG-1主要是因为自噬晚期阶段自噬小体与溶酶体的融合速率减慢。本文初步探究证明了在线虫中SNX-3可以通过影响自噬过程中自噬小体与溶酶体的融合过程参与自噬过程,这为进一步研究SNX-3在自噬过程的具体作用分子机制提供了基础和参考依据。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q25
【图文】：

过程图,自噬,过程

华中科技大学硕士学位论文构的自噬小体包裹需要降解的细胞质成分转运到溶酶体降解，当自噬过程发生缺陷如自噬出现下调或者过度上调时都会破坏细胞内稳态平衡。目前在线虫体内对于自噬过程的研究主要是巨自噬，因为没有研究数据证明线虫体内存在另外两种形式的自噬途径[9]。

自噬,步骤,过程

当营养物质缺乏时，TORC1 从溶酶体膜上被释放，自噬过程被诱导[13, 14]，持续的自噬活动会补充营养物质，进而又重新激活 TOR 抑制自噬。AMPK 信号路径也通过感知营养物质来调节自噬过程[15]。营养物质充足的情况下，mTORC1 被激活，激活的 mTORC1 磷酸化 ULK1/Atg1，磷酸化的 ULK1/Atg1不能与 AMPK 结合，因此 ULK1/Atg1 处于失活状态，自噬过程被抑制；营养物质缺乏时，AMPK 直接与 ULK1/Atg1 结合，并磷酸化激活 ULK1/Atg1 所需要的位点，因此AMPK 可以通过抑制 mTORC1 的活性，激活 ULK1/Atg1 诱导复合物来诱导自噬。人们发现自噬过程到现在已经有 50 余年，但是近十年才对自噬过程调节的分子机制有所研究。在酵母自噬基因的有关研究中，发现 ATG 蛋白家族中约 30 个基因参与调控自噬过程，它们分别作用于细胞自噬过程中的各个步骤，成为调控自噬的主要机制[16]，这些 ATG 蛋白具有高度保守性，参与从单细胞生物到多细胞生物的自噬调控过程。自噬过程可以分为五个不同的事件[3]：自噬的起始、吞噬泡的延伸、自噬小体的成熟、自噬小体与溶酶体融合、自噬小体包裹物在溶酶体中降解（图 1.2）。

自噬,分子机制

被 Atg4 切割下来，循环到细胞质中。Atg8 参与调节膜结构的延伸以及自噬小体的体积大小，Atg8 还可以作为接头蛋白通过结合包含 Atg8 家族蛋白结合区域（AIM）的蛋白将它们募集到自噬小体[28]。在线虫中的研究也识别出了两类泛素样复合物。LGG-1 和 LGG-2 是线虫体内 Atg8 的同源物，但是 LGG-1 与哺乳动物中 GABARAP相关性更强，而 LGG-2 与哺乳动物中 LC3 相关性更强。LGG-1 和 LGG-2 可以与包含 LIR/AIM 结构域的蛋白结合，但是它们在自噬过程的功能不同[9, 29]。LGG-1 参与自噬小体的形成以及自噬小体与溶酶体的融合，LGG-2 参与自噬小体与溶酶体的融合。LGG-1 在 LGG-2 的上游起作用，可以募集 LGG-2 到自噬小体，使自噬小体与晚期内吞体/溶酶体的融合。线虫体内有两种 Atg4 半胱氨酸蛋白酶的同源基因ATG-4.1 和 ATG-4.2。LGG-1 被 ATG-4.1 或 ATG-4.2 切割后，产生 LGG-1-I 的形式，在 ATG-7 和 ATG-3 作用下产生 LGG-1-II 的形式。LGG-1 和 LGG-2 的含量以及不同形式可以通过生化实验进行检测，LGG-1 在维持线虫的生长发育以及繁衍后代的能力中具有重要作用，而 LGG-2 在其中的作用不明显[30]。

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