代谢工程改造毕赤酵母促进乙酸生物利用

发布时间：2020-07-31 11:29

【摘要】：随着生物技术的飞速发展,微生物作为底盘细胞用于各类大宗或精细化学品的生产引起了广泛的关注和应用。目前,酵母底盘细胞多采用常规碳源葡萄糖和甘油,但如甲醇、乙醇、乙酸等非常规发酵碳源正在被越来越多地开发和利用。其中,乙酸是一种来源广泛、价格低廉、节能环保的碳源,可被直接催化为乙酰辅酶A而作为许多大宗和精细化学品的合成前体,因而受到广泛关注。毕赤酵母近年来被证实可以作为优良的底盘宿主用于小分子医药、化工产品的生物合成。本课题即尝试代谢工程改造毕赤酵母的乙酸耐受、转运和代谢过程以促进乙酸生物利用,进一步探讨乙酸作为碳源和生物合成前体的可行性。首先,乙酸的解离常数(pKa)为4.76,在低pH条件下对具有强烈的抑菌作用,涉及到一系列激酶相关的信号转导过程,是酵母中乙酸利用必须面对的难题。本研究利用课题组已构建的毕赤酵母激酶缺失文库筛选乙酸耐受相关激酶,进而通过激酶的缺失或过表达,提高细胞对乙酸的耐受能力。其中,毕赤酵母PAS_chr3_1091基因(命名为hrk1)缺失株对乙酸呈现强烈敏感表型,说明该基因对乙酸耐受有正面影响。因此我们构建了hrk1过表达菌株,同时以6-甲基水杨酸(6-MSA),作为报告化合物来评估乙酸利用效果,该化合物为真菌聚酮化合物,利用乙酰辅酶A为合成前体。hrk1过表达菌株的6-MSA产率最高可达80 mg/g cell,约为对照菌株的1.55倍。结果表明,hrk1过表达有效促进了6-甲基水杨酸的合成,能够促进乙酸的生物利用。其次,乙酸发生解离后存在两种形式,即分子形式的乙酸和离子形式的乙酸根离子,而酵母细胞膜上携带分别负责转运分子和离子形式乙酸的转运蛋白。由于酵母比较适合在偏酸性的环境中生长,因此我们推测增强分子形式乙酸的转运是促进乙酸利用的一个必要环节。有文献报道,酿酒酵母水-甘油通道蛋白ScFps1可促进乙酸分子转运,因此我们在毕赤酵母中过表达了酿酒酵母来源的ScFps1*并分析了胞外乙酸的消耗速率和6-甲基水杨酸的合成水平。结果表明,过表达ScFps1*未能有效促进乙酸的转运和6-甲基水杨酸的合成,说明该条件下毕赤酵母自身的乙酸分子转运水平很可能已经能满足需求。再者,细胞内乙酸的过量积累会导致一系列的细胞程序性死亡过程,因此加快胞内乙酸的快速转化也是加强乙酸代谢利用的关键步骤。乙酸可在微生物细胞内经乙酰辅酶A合成酶催化或乙酸激酶/磷酸转乙酰化酶共同催化而转化为乙酰辅酶A。本研究中通过过表达这些乙酸代谢相关基因,以6-MSA作为报告化合物,分析了它们对乙酸代谢利用的作用效果。毕赤酵母来源的乙酰辅酶A合成酶PpAcs1和酿酒酵母来源的乙酰辅酶A合成酶ScAcs1*能够促进毕赤酵母中乙酸的利用,它们的6-MSA产率最高可达47.0 mg/g cell和43.7 mg/g cell,分别是对照株的1.39倍和1.30倍。而大肠杆菌来源的乙酸激酶AckA和磷酸转乙酰化酶Pta则没有明显的促进作用。最后,将乙酸耐受和乙酸代谢两部分中可以促进乙酸代谢的基因进行了组合表达,进一步促进了乙酸生物利用。该研究通过改造毕赤酵母的乙酸耐受、转运和代谢过程,有效地促进了毕赤酵母底盘宿主的乙酸生物利用能力,为利用酵母宿主生物合成以乙酸和乙酰辅酶A为前体的医药、化工产品提供了参考。但由于毕赤酵母受乙酸严重杀伤的天然生理特性,要实现毕赤酵母利用乙酸为碳源进行高效生长及产物合成依旧需要持续的深入研究。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

逡逑１．２．２真核生物的乙酸代谢逡逑在酿酒酵母中，乙酰辅酶Ａ合成酶（Ａｃｓ）催化乙酸转化为乙酰辅酶Ａ邋（图１．３）。Ａｃｓ逡逑由两个基因编码，分别是ａｃｓ／和ａｃｓ２。ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇ等…］比较了这两个蛋白相应的动力逡逑学参数，Ａｃｓｌ对底物乙酸的值比Ａｃｓ２要低３０倍，基因ｗｓ／的表达受到高浓度葡逡逑萄糖和厌氧条件的限制，对非葡萄糖碳源条件的代谢十分关键。逡逑Ｃｈｅｎ等Ｍｌ发现，在酿酒酵母中过表达细胞内的乙酰辅酶Ａ水平是原先的２．１９逡逑倍，ＡＴＰ提高了邋３．９２倍，细胞对乙醇的耐受能力明显提升。Ｙｏｉｃｈｉｒｏ等在酿酒酵母中逡逑过表达乙醛脱氢酶（Ａｌｄ６）和乙酰辅酶Ａ合成酶（Ａｃｓｌ），提升了异戊二烯的产量。乙醛在逡逑

ｉ邋Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ邋丨逡逑Ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ逡逑图１．２酿酒酵母的乙酰辅酶Ａ代谢概览Ｗ逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｉｎ邋ｉｎ邋Ｓ．邋ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．逡逑在以大肠杆菌和酿酒酵母为宿主菌的工业发酵生产中，乙酰辅酶Ａ衍生品的产量逡逑也有较大的差别。大肠杆菌中乙酰辅酶Ａ直接在胞质中被利用，而酵母中乙酰辅酶Ａ的逡逑代谢则被分割在不同的区室，包括线粒体、过氧化物酶体、细胞核和胞质。其中，乙酰逡逑辅酶Ａ主要在线粒体产生，但酿酒酵母自身缺少将乙酰辅酶Ａ直接从线粒体转运至胞逡逑质的机制１１１］。因此，当乙酰辅酶Ａ衍生物合成时，乙酰辅酶Ａ不能得到充分利用。胞逡逑质中的乙酰辅酶Ａ虽然由乙酸直接转化而成，但乙酰辅酶Ａ合成酶Ａｃｓ对底物的亲和逡逑性较低并且需要耗能［｜２］，成为一个限速步骤。因此，乙酸作为碳源和生物合成前体，可逡逑以在一定程度上解决细胞内乙酰辅酶Ａ不足的问题

比较特殊的是，谷氨酸棒状杆菌画ｇ７ｗ／

本文编号：2776411