玉米响应高温胁迫的转录组测序及关键调控基因的鉴定与分析

发布时间：2020-08-06 20:13

【摘要】：在植物生长和防御非生物胁迫(如高温等)等分子机制中,热激转录因子(Heat shock factors,HSF)、热激蛋白(Heat shock proteins,HSP)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)起着至关重要的作用。玉米(Zea mays)作为重要的粮食作物,易受到不良环境如高温、水涝等影响,从而导致产量和质量下降。目前,关于玉米高温胁迫下HSP、HSF、APX和CAT基因家族的研究较少,因此,对其进行分子生物学研究揭示它们在植物抗逆过程中的生物学功能将为提高玉米的产量和质量具有重要理论意义和应用价值。本研究利用最新测序的玉米基因组数据库,通过生物信息学方法对玉米HSP、HSF、APX和CAT基因家族成员进行全基因组鉴定与分析;通过转录组测序分析在高温胁迫下玉米B73品系中基因表达情况;利用实时荧光定量技术研究玉米HSP、HSF、APX和CAT基因家族在高温胁迫下的表达情况。为明确玉米HSP、HSF、APX和CAT的功能及在抗高温过程中分子机制奠定基础。本研究主要获得的实验结果如下:1.从玉米B73基因组中鉴定得到25个HSF、35个HSP(其中包括22个HSP70,2个HSP40,2个HSP90和9个s HSP)、8个APX和5个CAT基因,并鉴定其理化性质;通过对玉米、拟南芥和水稻三个物种中的HSP、HSF、APX和CAT基因进行系统进化分析,确定了其在进化上的亲缘关系;外显子-内含子结构分析表明,其各个基因家族成员所含内含子和外显子的数目存在很大差异,内含子的长度也不尽相同,这些原因都可能造成基因功能的多样性;通过对玉米HSF和HSP家族基因的蛋白质基序分析表明,不同蛋白的结构在保守基序上存在明显的差异,为其功能的分化提供了依据;通过对玉米HSF和HSP家族基因在不同组织中的表达谱分析表明,基因表达具有组织特异性。2.利用RNA-Seq技术对对照组和实验组(高温处理)材料进行转录组测序分析,结果分别从35209446和35205472个Clean data中共鉴定出1857个差异表达基因(DEGs,1029个上调,828个下调),DEGs的KEGG途径富集分析表明,内质网途径中的蛋白质加工在玉米响应高温胁迫反应中起着重要作用;此外,还鉴定出167个可能与玉米响应高温胁迫有关转录因子(TF,Transcription factor),它们属于不同的TF家族(例如,HSF、MYB、AP2-EREBP、b-ZIP、b HLH、NAC和WRKY)。结果表明,玉米响应高温胁迫的过程中有许多基因发生了差异性表达。3.利用qRT-PCR技术进一步验证了玉米HSP、HSF、APX和CAT基因家族成员在高温下的表达情况,结果表明,高温胁迫处理可诱导这些基因家族中的大部分成员表达量上调,但也存在部分基因下调,说明这些基因对玉米幼苗响应高温胁迫的过程中所发挥的功能是可能不同。此外,这些基因在不同的组织器官中的表达量存在差异,说明其调控作用可能存在组织特异性。
【学位授予单位】：安徽师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;Q945.78
【图文】：

热激,信号转导途径,植物

图 1. 植物热激信号转导途径[54]Fig.1. Plant heat shock signal transduction pathway2．植物热激转录因子的研究进展热激转录因子（HSFs）是维持生长、适应环境变化，植物形成的复杂有效防御体系中响应逆境信号的中心元件[53-55]。HSF 首先在酵母中被发现，随后植物中首次报道出 HSF 是 1990 年关于热胁迫下的番茄中[56]。随着生物测序技术和生

氨基酸序列,框图表示,番茄,基本结构

binding domain，DBD)是一个包含反向平衡的β-折叠 (β1,β2,β3和结构(α1,α2和α3)的高度保守的区域，它专门定位和识别目标启动元素 (Heat shock element, HSE) 并结合，随后激活应激响应基因具有2个疏水7肽重复区域即疏水氨基酸残基 (HR-A/B区域)的merization domain，OD）通过15 ~ 80 个碱性氨基酸与DBD连接位信号（Nuclear localization signal，NLS）是一段保守的碱性氨基域，可引导HSF进入细胞核[67]；细胞核输出信号（Nuclear export位于HSF的C 端，富含亮氨酸的结构域，其可帮助HSF从细胞核输69]。AHA基元是激活结构，其含有大量疏水性氨基酸残基（L、I、氨基酸残基（W、F、Y）和酸性氨基残基酸（E、D）[70]。转录抑essor domain，RD）是一段-LFGV-氨基酸序列，具有转录阻遏功能

玉米种子,文库

图 3A. 玉米种子图 3B. 玉米幼苗Fig 3A. Corn seed Fig 3B. Corn seedlings2.2 转录组学测序方法简述2.2.1 总 RNA 分离，mRNA 文库构建和测序使用 Trizol 试剂（Invitrogen，CA，USA）制备叶中的总 RNA。通过分光光度计测 260/280nm 吸光度比值确定总 RNA 量和纯度。在 Illumina 测序文库制备之前，将来自三个生物重复的总 RNA 混合用于所有六个 RNA 文库。用聚-T-寡聚体附着的磁珠（Invitrogen，USA）分离大约 10μg 的总 RNA。纯化后，在高温下使用二价阳离子将 mRNA 片段化成小片，然后将裂解的 RNA 片段逆转录以产生 mRNA-seq 样品制备试剂盒（Illumina，San Diego，USA）的最终 cDNA 文库，根据操作手册。配对末端文库的平均插入大小为 300bp（±20bp），然后在 IlluminaHiseq 2500 平台上进行配对末端测序。

【参考文献】