薄皮甜瓜CmLOX08基因的克隆及其在干旱和盐胁迫中的功能分析
发布时间：2020-08-08 07:31
【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwa Makino)是葫芦科甜瓜属(Cucumis melo L.)一年生草本植物,在设施栽培中,其产量和品质严重受到非生物胁迫的影响。前人研究发现脂氧合酶(Lipoxygenase,LOXs)在植物应答非生物胁迫中具有重要的作用,因此研究LOX基因的功能可为通过基因工程提高薄皮甜瓜抗逆性提供一定的理论基础。尽管最近几十年来越来越多的植物中发现了新的LOX基因,但是对于薄皮甜瓜中LOXs基因的研究较少。本文以薄皮甜瓜'玉美人'为材料,通过PCR技术克隆了 CmLOX08的基因编码区序列,并对其进行生物信息学分析;利用烟草瞬时表达的方法鉴定了CmLOX08的亚细胞定位;通过PlantCARE和PLACE数据库分析CmLOX08启动子中与信号物质和非生物胁迫相关的顺式作用元件,并利用烟草瞬时表达方法对CmLOX08的启动子进行了功能分析;利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术沉默CmLOX08,探索了 CmLOX08在干旱和盐胁迫中的功能,同时将CmLOX08在拟南芥中过表达,进一步验证其功能。主要结果如下:1.从甜瓜叶片中克隆了 CmLOX08基因序列,CmLOX08的ORF长度为2790 bp,编码929个氨基酸,分子量为104.93 kDa,等电点为8.44。CmLOX08蛋白具有脂氧合酶家族的LOX保守结构域,以及与脂氧合酶相关的PLAT_LH2和LH2保守结构域,推测其为13S-LOXs。使用Infusion方法构建CmLOX08过表达载体,转入农杆菌GV3101中,通过在烟草叶片中瞬时表达,发现CmLOX08蛋白定位在细胞膜上。2.通过PCR技术获得了 CmLOX08启动子序列,并且利用生物信息学软件预测启动子序列上的顺式作用元件。CmLOX08启动子序列长度为2054 bp,与甜瓜基因组数据库中GeLOX08-pro的核苷酸序列具有99.61%的同源性。利用在线软件PlantCARE和PLACE分析CmLOX08启动子序列,发现了 30种与信号物质和非生物胁迫相关的顺式作用元件,如与脱落酸(ABA)响应相关的ABRE元件,与干旱响应相关的MYB结合位点以及与盐胁迫相关的GT1GMSCAM4元件等。3.根据顺式作用元件的位置,构建薄皮甜瓜CmLOX08 5'缺失启动子植物表达载体,通过注射法在烟草叶片中瞬时表达后,对烟草叶片进行信号物质和非生物胁迫处理。GUS组织化学染色和荧光定量分析表明,除茉莉酸甲酯外,信号物质脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和过氧化氢(H2O2)均可调节CmLOX08启动子的活性;在盐、干旱和机械损伤处理下,-1047～-1-bp启动子区域诱导GUS活性最高,是响应3种胁迫的主要区段;同样,研究发现启动子中-1284～-1-bp和-1047～-1-bp区段分别是应答高温和低温的核心序列。以上结果表明,CmLOX08启动子的活性受各种信号分子和非生物胁迫的调节,是一个信号分子/胁迫诱导型启动子。4.利用VIGS技术并结合甜瓜子叶注射法,沉默CmLOX08;构建CmLOX08过表达载体,通过花序浸润法转化拟南芥。对沉默植株和转CmLOX08拟南芥进行干旱处理,发现与对照植株相比,CmLOX08沉默植株的LOX活性和胁迫基因表达水平降低,H2O2积累增加,对干旱胁迫更加敏感;相反,过表达CmLOX08增强了拟南芥对干旱胁迫的抗性,减少了氧化伤害,提高了 LOX活性和胁迫响应基因的表达。因此,CmLOX08可能通过调控LOX活性、H2O2积累和胁迫基因表达水平来提高对干旱的抗性。5.对沉默植株和转CmLOX08拟南芥进行盐胁迫处理,发现与对照植株相比,CmLOX08沉默植株的LOX活性和胁迫响应基因的表达受到抑制,H2O2的积累增加,降低了对盐胁迫的抗性;然而,转CmLOX08拟南芥的LOX活性和胁迫基因表达水平始终高于野生型,H2O2的积累较少,表现出更好的耐盐性;此外,沉默CmLOX08能够显著降低叶片中JA含量,同样,过表达CmLOX08显著提高叶片中JA含量。这些结果表明了 CmLOX08可能通过调控LOX活性、H2O2积累、胁迫基因表达水平以及JA水平来提高对盐胁迫的抗性。综上,CmLOX08基因的ORF长度为2790 bp,定位在细胞膜上;CmLOX08启动子的活性受信号物质脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和过氧化氢(H2O2)以及非生物胁迫干旱、盐、机械损伤、高低温的调节;CmLOX08通过提高LOX活性、胁迫基因表达水平和清除活性氧能力来增强植物的抗旱和抗盐性,且抗盐性的提高与JA水平有关。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S652;Q943.2
【图文】：
二．燥氧化物含酶（Ａｌｌｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＯＳ）支路。ＨＰＬｆ＾够催逡逑化脂肪酸碳骨架氧化裂解，形成Ｃ６或Ｃ９醛、醇和相应的Ｃ１２和Ｃ９脂肪酸等挥发性物逡逑质（ＧＬＶｓ）。如图１－１所示，ＬＯＸ催化底物亚麻酸碳氢骨架的Ｃ９和Ｃ１３位点的过氧逡逑化反应，产物为９－氢过氧化物（９－ＨＰ０Ｔ）和１３－氢过氧化物（１３－ＨＰ０Ｔ）。９－氢过氧化逡逑物经过氢过氧化物裂解酶、醇脱氢酶催化最终生成Ｃ９醛、醇挥发性物质，１３－ＨＰ０Ｔ最逡逑终生成Ｃ６醛、醇。在逆境胁迫下，Ｃ６绿叶挥发物不仅能够促进胁迫相关基因表达（Ｂａｔｅ逡逑ａｎｄ邋Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９９８），．并：且能够激发抗病h澘浯迹ǎ校颍铮螅翦澹澹翦澹幔欤玻埃埃担＃保常毯厦稿义希ǎ保常蹋希兀┐呋幔瓈r：麻酸产生１３－ＨＰＯＴ，然后在ＡＯＳ和ＡＯＣ的作用下生成１２－氧－植逡逑物二P懰幔ǎ保玻铮铮穑瑁簦铮洌椋澹睿铮椋沐澹幔悖椋洌希校模痢怠Ｋ婧螅忱蛩嵊慑澹希校模铃逦遥海保玻酰参锒义舷┧峄乖傅淖饔孟戮陈郑醒趸铣
本文编号：2785267
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S652;Q943.2
【图文】：
二．燥氧化物含酶（Ａｌｌｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＯＳ）支路。ＨＰＬｆ＾够催逡逑化脂肪酸碳骨架氧化裂解，形成Ｃ６或Ｃ９醛、醇和相应的Ｃ１２和Ｃ９脂肪酸等挥发性物逡逑质（ＧＬＶｓ）。如图１－１所示，ＬＯＸ催化底物亚麻酸碳氢骨架的Ｃ９和Ｃ１３位点的过氧逡逑化反应，产物为９－氢过氧化物（９－ＨＰ０Ｔ）和１３－氢过氧化物（１３－ＨＰ０Ｔ）。９－氢过氧化逡逑物经过氢过氧化物裂解酶、醇脱氢酶催化最终生成Ｃ９醛、醇挥发性物质，１３－ＨＰ０Ｔ最逡逑终生成Ｃ６醛、醇。在逆境胁迫下，Ｃ６绿叶挥发物不仅能够促进胁迫相关基因表达（Ｂａｔｅ逡逑ａｎｄ邋Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９９８），．并：且能够激发抗病h澘浯迹ǎ校颍铮螅翦澹澹翦澹幔欤玻埃埃担＃保常毯厦稿义希ǎ保常蹋希兀┐呋幔瓈r：麻酸产生１３－ＨＰＯＴ，然后在ＡＯＳ和ＡＯＣ的作用下生成１２－氧－植逡逑物二P懰幔ǎ保玻铮铮穑瑁簦铮洌椋澹睿铮椋沐澹幔悖椋洌希校模痢怠Ｋ婧螅忱蛩嵊慑澹希校模铃逦遥海保玻酰参锒义舷┧峄乖傅淖饔孟戮陈郑醒趸铣
本文编号：2785267
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