优雅蝈螽生物钟基因cDNA全长克隆及表达研究

发布时间：2020-08-21 09:12

【摘要】：昼夜节律是最常见、研究最深入的一类生物节律。模式生物黑腹果蝇Drosophila melanogaster中已鉴定出多个生物钟基因,发现这些基因及其表达产物共同组成的转录-翻译反馈环路构成其生物钟核心分子机制,关于黑腹果蝇以外昆虫的生物钟基因研究较少。优雅蝈螽是1种人们喜闻乐见的鸣虫,其鸣叫具有明显的昼夜节律性,每日早晚各有1个鸣叫高峰。对优雅蝈螽的鸣叫节律调控进行深入研究有助于理解发声昆虫的鸣叫机理,具有较为重要的科学意义。本研究在前期测得优雅蝈螽成体转录组数据的基础上,对period(per)、timeless(tim)、cryptochrome(cry)和clockwork orange(cwo)4个生物钟基因进行3个方面研究。首先,利用RT-PCR、RACE等技术获得上述4个生物钟基因的cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析。然后,通过实时荧光定量PCR研究4个生物钟基因在优雅蝈螽不同发育阶段头部、成虫不同组织中的相对表达量。最后,在3种光周期(自然光周期、L:D=12:12光周期、D:L=12:12黑白颠倒光周期)驯化1周后,分别于0:00、6:00、12:00和18:00解剖取优雅蝈螽雄性成虫头部和精巢进行相对表达量检测。结果如下:1.获得优雅蝈螽生物钟基因per、tim、cry和cwo的完整开放阅读框,分别命名为Ggper、Ggtim、Ggcry和Ggcwo,长度分别为3576 bp、2622 bp、1941 bp和1773 bp,分别编码1191、873、646和590个氨基酸,预测蛋白分子量分别为131.15 kDa、99.53 kDa、74.23 kDa和65.08 kDa,理论等电点pI分别为6.09、6.02、7.57和6.41。氨基酸序列比对发现与其他昆虫生物钟基因一致性高,均在60%以上。结构域分析发现均具有生物钟基因保守的功能域,分别为GgPER的PAS结构域、PAC结构域、Period_C结构域、核定位信号NLS和细胞质定位信号CLD;GgTIM的TIMELESS结构域、核定位信号NLS、保守区段PER-1和PER-2;GgCRY的DNA-photolyase结构域和FAD-binding-7结构域;GgCWO的HLH结构域和ORANGE结构域。进化分析结果与氨基酸序列比对结果基本一致。以上这些特点均符合生物钟基因的特性,表明本实验克隆获得的4个基因属于优雅蝈螽生物钟基因。2.优雅蝈螽生物钟基因Ggper、Ggtim、Ggcry和Ggcwo的时空表达模式分析结果:4个生物钟基因在雌雄虫体各发育阶段均有表达且差异显著(P0.05),若虫期的表达量高于成虫期,推测生物钟基因可能在其若虫期的蜕皮过程中起到重要作用;生物钟基因在雌雄成体不同组织中均有表达且具有显著差异(P0.05),同一基因在雌雄成虫中的表达模式基本一致,推测这4个生物钟基因在优雅蝈螽成虫中发挥的作用一致。3.自然光周期条件下,4个生物钟基因在雄性成虫头部中均呈现出明显的昼夜节律性表达,而在精巢中Ggper、Ggtim和Ggcry呈现出明显的昼夜节律性表达,Ggcwo昼夜节律性不明显。改变光周期之后,4个生物钟基因在雄性成虫头部和精巢中均呈现出明显的昼夜节律性表达且Ggcry受光周期影响较明显。另外在自然光周期下,Ggper和Ggtim在雄性成虫头部和精巢中表达趋势一致;在雄性成虫头部Ggcwo呈现昼夜节律并与Ggtim和Ggper的波动趋势基本一致,但在精巢中不具有昼夜节律性。结合4个生物钟基因的序列及其表达模式,本研究初步推测在优雅蝈螽中GgPER和GgTIM结合形成异二聚体并进入细胞核发挥转录抑制作用;GgCRY可能具有光信号传导和转录抑制的双重作用;GgCWO与GgPER和GgTIM协同作用,在头部节律性表达并发挥转录抑制作用。本研究不仅为探究优雅蝈螽鸣叫节律提供了丰富的数据资源,同时也为后期开展生物钟基因功能方面的相关研究奠定了基础。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

示意图,果蝇,示意图

mRNA 生成和蛋白质表达节律在时间上几乎是相反的。过量表达的 PE per mRNA 的波动，即 PER 蛋白对其自身基因的转录具有负调控作用[40, mRNA 的转录控制和 PER 蛋白的依赖性抑制进步完善了 PER 在这个为转录抑制因子的作用。随后的研究不仅支持这个转录反馈回路在果蝇中时间的观点，而且表明的确存在类似情况[60]。了解生物钟分子机制的同时，通过神经解剖学的研究，昼夜节律的相关神受到更多的关注[61]。John Ewer 和 Brigitte Frisch 描述了 per 基因表达的侧lnvs）的腹侧和背侧神经元簇[62]。果蝇的脑内有大约 150 个神经元（图 1昼夜节律起到重要作用[63]。然而目前，在果蝇中发现的分子钟仅仅位于果的小部分而已。过基因筛选、分子间相互作用分析、启动子分析以及对生物钟基因同源体发现更多的生物钟基因。

生物钟,果蝇

图 1-2 果蝇的生物钟系统[29]Figure 1-2 The circadian system of Drosophila melanogaster蝇的第二个转录-翻译反馈回路中，涉及两个新的转录因子 vri 和 pdp1εCYC 异二聚体的另外两个直接靶点[108, 121]。CLK-CYC 通过与 E-box 结合p1ε 的转录，VRI 和 PDP1ε 蛋白随之开始积累。PDP1ε 的翻译以延迟的方ε 在深夜增加。VRI 和 PDP1ε 进入细胞核，与 clk 的启动子内的 I/PDP1ε-boxes）结合，VRI 抑制而 PDP1ε 激活 clk 的转录。当 CLK-CYC 受 pdp1ε 的转录也被抑制，其 mRNA 和蛋白水平也随之减少[122]。蝇的第三条转录-翻译反馈回路中，包括 clk、cyc 和新发现的核心钟基在 CLK-CYC 的调节下有节奏地表达到峰值，并形成自己的负反馈回路。box 元件抑制其他生物钟基因的表达，如 per 和 tim。这个负反馈回路有的昼夜振荡。分子振荡器精确的时间掌控及其功能而言，时钟蛋白的翻译后调控显得

氨基酸序列,cDNA序列,氨基酸序列,结构域

图 3-2 Ggper 的 cDNA 序列及其推导的氨基酸序列Figure 3-2 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Ggper cDNA方框内 ATG 和 TGA 分别为起始密码子和终止密码子。黄色、橙色和绿色区域分别是两个 PAS 结构域、PAC 结构域和Period_C 结构域。TheATG and TGAindicate the start codon and the stop codon in thebox, respectively; the domains of PAS, PAC and Period_C are shaded in yellow, orange and green,respectively.表 3-2 GgPER 的氨基酸组成Table 3-2 The amino acids composition of GgPER氨基酸Amino Acids数量Quantity含量Content氨基酸Amino Acids数量Quantity含量ContentAla (A) 65 5.5% Leu (L) 87 7.3%Arg (R) 44 3.7% Lys (K) 81 6.8%Asn (N) 53 4.5% Met (M) 36 3.0%Asp (D) 54 4.5% Phe (F) 39 3.3%Cys (C) 23 1.9% Pro (P) 90 7.6%Gln (Q) 46 3.9% Ser (S) 143 12.0%Glu (E) 90 7.6% Thr (T) 74 6.2%

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