耐辐射奇球菌多聚磷酸盐代谢关键酶的生化功能与结构研究

发布时间：2020-08-22 04:14

【摘要】：耐辐射奇球菌(Deidoioccus ridurans,简称DR)是一种能忍受极端环境的微生物,对电离辐射、紫外线、干燥等环境压力有极强的抗性。作为研究极端环境压力抗性的模式生物之一,研究其生存机制对认识生物面对极端环境的生命活动和自然规律有着重要的意义。本研究通过生化与分子生物学等手段研究了耐辐射奇球菌的多聚磷酸盐(Polypphosphate,PolyP)代谢及其关键酶功能,在分子水平上阐明了 PolyP的降解机制,还研究了铁离子转运相关的蛋白DR1440,探究了它们在DR菌应对氧化胁迫压力中的重要作用。首先,我们通过生物信息学、DAPI染色法、Urea PAGE等生化实验方法预测并鉴定了 DR基因组内编码PolyP合成酶polyphosphate kinase(DrPPK)和降解酶exopolyphosphatase(DrPPX)的基因。通过菌株生长表型分析发现,PolyP合成缺失会影响其生长;在氧化压力H2O2胁迫下,drppk和drppx的转录和翻译水平均上调,并且drppx相对于drppk的上调更为明显;与野生型比较,drppk的缺失则导致胞内基本无PolyP积累,同时对H2O2杭性更强;而dpppx突变株则在氧化压力刺激后产生PolyP水平增加,对H202更为敏感。通过ICP-MS检测发现增加的PolyP螯合了更多的胞内Mn2+,可能引起胞内具有抗氧化活性的Mn2+含量减少,从而导致菌体氧化抗性下降。结果表明,drppx及其反应产物可能参与了 DR菌的氧化压力抗性等。其次,通过解析耐辐射奇球菌DrPPX的结构发现,不同于大肠杆菌EcPPX的紧密结构,DrPPX是一种新型的二聚体形式PPX,其结构相对较为松散并且活性中心更为开放;在Mn2+存在下形成二聚体从而激活其PolyP外切酶活性,其产物可能以Mn2+和Pi的复合物形式参与耐辐射奇球菌的氧化抗性,且E114是DrPPX的关键催化活性位点。另外,我们首次解析了 DrPPX-PolyP的复合物结构。N端的活性中心的H14、K35、R37、R271等带正电荷的氨基酸和T10、S12、T82、S141、S212等含羟基的氨基酸参与了底物PolyP的结合;C端结构域则为DrPPX二聚化所必需,其缺失会导致酶活下降;C末端的4个氨基酸参与了 Mn2+的结合,分别是H340、H377、E378、D453,其中D453位点起决定性结合作用,突变后形成不可二聚化的单体蛋白,且酶活下降。通过对C端截短的DrPPX蛋白结构分析可知,C端可能是通过结合Mn2+形成空间作用力于N端,从而促进加强PolyP的降解作用。通过DrPPX蛋白C端截短突变和E114点突变补偿株的氧化抗性表型分析,进一步验证了 DrPPX对于耐辐射奇球菌氧化抗性具有重要意义。DrPPX和DrPPK通过控制polyP的合成与降解调控胞内游离Mn2+的浓度参与氧化胁迫响应,而胞内锰铁含量比(Mn/Fe)的高低是影响耐辐射奇球菌抗氧化能力的重要因素。因此,除了 Mn2+平衡外,胞内Fe2+代谢对于DR的氧化抗性也至关重要。本研究鉴定了耐辐射奇球菌中的一个潜在的铁外排通道蛋白DR1440。通过序列分析表明,DR1440是一个隶属于P-typeATPase家族中的一个PIB-typeATPases,可能参与转运重金属离子。通过构建dr1440缺失突变株,发现突变株胞内铁离子的水平提高,并且对亚铁离子更为敏感;同时对过氧化氢(H2O2)、γ射线辐照等氧化压力也更为敏感。在H202的压力下,突变株胞内产生了更多的ROS并导致更严重的蛋白羰基化,表明氧化压力下耐辐射奇球菌DR1440可能通过铁离子的外排作用,防御细胞内由于亚铁离子介导的Fenton反应形成ROS对蛋白、核酸等生物大分子的氧化损伤。最后,我们通过点突变发现了 DR1440的SPC motif中的S297和C299两个位点的突变会导致胞内铁的积累同时对H202压力表现得更为敏感,表明S297和C299可能是DR1440的重要功能位点。本研究鉴定了耐辐射奇球菌中PolyP代谢关键酶及其功能,首次发现外切酶DrPPX特殊的二聚体调控机制及其酶催化的分子机制,揭示了 PolyP代谢与氧化压力胁迫的关系。另外,研究发现了铁离子转运相关蛋白DR1440,探讨了其在菌体应对氧化压力胁迫中的作用。研究结果一方面拓宽了对参与多聚磷酸盐代谢的外切酶的催化和调控机制的认识,另外加深了对多聚磷酸盐、Mn、Fe参与氧化压力胁迫抗性的全局认识,为揭示耐辐射奇球菌极端环境抗性机理提供新的思路。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936

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