产烷基间苯二酚的酿酒酵母工程菌株的构建及代谢改造

发布时间：2020-08-28 10:53

　　 作为1,3-间苯二酚苯环5位被长链烷基取代的一类酚类类脂,烷基间苯二酚(Alkylresorcinols,ARs)是谷物皮层的重要活性成分和标记物,也是粮食行业标准(LS/T3244—2015)评判全麦粉的重要生物标记物。ARs具有抗氧化、抗寄生虫、抗肿瘤、抑菌、降糖降脂等生理活性。目前,大部分的ARs是通过从植物中提取而来,而植物中存在ARs含量低并不能满足市场的需求,本文通过生物合成方法来大量生产ARs。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种代谢背景清晰、基因组已知的真核模式生物,具有良好的耐酸性、遗传操作简便、易培养等优点。本文以酿酒酵母作为表达宿主,将优化后的黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor)ARSs基因与pRS42H载体构建重组质粒,并使用LiAc/PEG化学转化法将重组质粒转化酿酒酵母,构建产ARs的重组酿酒工程菌株SN001、SN002和SN003,重组菌株在30℃、YPD培养基中发酵培养,SN001、SN002和SN003重组酵母ARs产量分别是44.5±3.1μg/mL、23.5±2.3μg/mL、28.3±2.9μg/mL。乙酰辅酶A是生物体内重要的活性中间体,为了研究其对酵母中ARs合成与积累的影响,分别在酵母中敲除消耗乙酰辅酶A的支路的基因,并过表达合成乙酰辅酶A的基因。文本敲除MLS1(Malate synthase,MLS1)和CIT2(Citrate synthase,CIT2)基因,考察各突变菌株ARs的合成能力,发现MLS1和CIT2基因单独缺失有利于提高重组酵母菌株对ARs的合成与积累。MLS1基因缺失使SN009、SN011和SN013菌株的ARs最高产量分别为60.9±2.2μg/mL、54.6±3.7μg/mL和50.5±4.3μg/mL,较重组酵母菌株提高了0.4倍、1.3倍、0.65倍。△CIT2基因缺失使SN010、SN012和SN014菌株的ARs最高产量分别是58.7±3.2μg/mL、50.3±2.6μg/mL和63.1±2.1μg/mL,较重组酵母菌株提高了0.56倍、1.19倍、1.22倍。为了进一步提高ARs产量,同时在酿酒酵母中敲除MLS1和CIT2基因,使SN016、SN017和SN018菌株产量分别达到75.4±1.8μg/mL、60.9±1.2μg/mL和68.6±2.6μg/mL,较重组酵母分别提高了0.7倍、1.67倍,1.41倍。以酿酒酵母基因组为模板,分别扩增ACS1(Acetyl-CoA synthetase,ACS1)和DGA1(DiacylGlycerol Acyltransferase,DGA1)基因,将改造后的酿酒酵母表达载体pESC-trp与ACS1和DGA1基因以及目的基因连接构建过表达质粒,然后将过表达质粒转入酵母后构建过表达酵母菌株。研究表明SN020、SN022和SN024菌株产量分别是72.6±3.3μg/mL、51.6±3.2μg/mL、59.3±3.5μg/mL,较重组酵母菌株分别增加了0.6倍、1.2倍、1.1倍。SN021、SN023和SN025菌株产量分别达到54.6±2.9μg/mL、32.8±2.5μg/mL、39.6±3.1μg/mL,较重组酵母菌株提高了0.2倍、0.4倍、0.4倍。本文主要以优化后的黑麦和高粱的ARSs(Alkylresorcinol synthase,ARSs)基因基础,构建产ARSs酿酒酵母工程菌株,研究了不同工程菌生物合成烷基间苯二酚的能力,并进行了初步的代谢改造,为生物合成法制备ARs研究奠定基础。
【学位单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;TS261.11

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本文编号：2807490