转录因子NbNAC1调控植物系统性抗性防御病毒入侵的机制及其蛋白抗体制备

发布时间：2020-08-31 13:33

　　在植物面对不断变化的环境中,基因表达调控网络几乎参与了所有的过程。转录因子是调节基因表达水平的关键,而NAC转录因子是植物特有的转录因子,能够参与调控植物多种生物过程。但是有关NAC转录因子调控植物激素信号传导途径来应答病毒入侵的机制还很不清楚。我们研究了本生烟NbNAC1转录因子调控植物激素信号传导途径来应答病毒入侵的机制。首先我们通过RT-PCR的方法成功从本生烟中克隆得到NbNAC1的全长序列。系统发生进化树构建的结果表明,NbNAC1与抗逆反应相关的转录因子番茄S1NAC1和辣椒CaNAC1的亲缘关系最近。共定位实验表明NbNAC1定位于细胞核,酵母单杂交实验证明了其C端具有转录激活活性。荧光定量PCR结果表明,烟草花叶病毒(TMV)侵染本生烟后能够诱导NbNAC1基因的表达。然后我们利用病毒诱导的基因沉默技术将NbNAC1的表达成功抑制后接种TMV。和对照相比,沉默NbNAC1的植株中病毒大量积累,并且沉默植株中活性氧爆发。说明抑制NbNAC1的表达,植物的系统性抗性减弱。进一步研究表明,沉默NbNAC1的植株,水杨酸(SA)含量显著下降,SA合成与信号途径关键酶基因MbICS1、NbNPR1、以及SA介导的防御基因NbPR1、NbPR2、NbPR5的表达显著下调。之后同时缺失SA和NAC信号,研究植物系统性抗性是否发生变化。在接种TMV后,同时缺失SA和NAC信号的植株中病毒大量积累,活性氧爆发,植物变得对TMV超级敏感,丙二醛和电导率的结果也表明细胞膜损伤更为严重,说明植物的系统性抗性进一步显著减弱。另外利用水杨酸处理缺失NAC信号的植株,结果显示可以部分地恢复由于缺失NAC信号所丢失的抗性。因此我们认为,NbNAC1转录因子在调控植物系统性抗性防御病毒入侵过程中起重要作用,可能调控SA信号途径应答病毒入侵。该研究为利用基因工程原理改良农作物的抗逆性,培育优良品种,增强植物对病原菌的抵抗力提供重要的理论依据。为了更深入研究转录因子NbNAC1在激素信号网络中作为关键调控因子的调控作用,探索NbNAC1与水杨酸信号转导途径蛋白质互作模式,有必要通过DNA重组技术获得NbNAC1重组蛋白并制备血清抗体。原核表达系统能够便捷高效地获得目的蛋白,因此构建高效的表达体系是获得NbNAC1蛋白的关键。我们选择了两种标签的表达载体,成功构建了 pET28a-NbNAC1和 pGEX-4T-1-NbNAC1 载体,利用 E coil Rosetta(DE3)菌株进行表达。通过对诱导条件探索,我们发现两种载体都是在37℃、1mMIPTG诱导条件下表达量最大。经SDS-PAGE电泳检验,pGEX-4T-1-NbNAC1载体表达的蛋白是可溶性蛋白,主要集中在上清中可以直接用GST介质纯化。而pET28a-NbNAC1载体表达后形成包涵体蛋白,主要集中于沉淀中,我们利用包涵体复性技术,成功制备NbNAC1蛋白。将蛋白乳化处理后,直接对大白兔进行注射,获得血清抗体,经Westernb1ot检测,获得的血清抗体具有较高效价,可以用于后续实验。本研究探索了两套解决原核表达包涵体蛋白问题的方案,成功纯化出NbNAC1蛋白并制备出血清抗体,为后续研究NbNAC1与SA互作奠定基础,也为原核表达体系中包涵体问题的解决提供新的策略。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

氨基酸序列,转录因子,结构示意图

经注释编码基因的５．９％，转录因子做为复杂的信号网络中的成员，在调节植物应对来逡逑围环境胁迫反应的过程中，发挥着重要的作用ｔ２＂６１。逡逑ＮＡＣ转录因子其命名来源于科学家从矮牵牛和拟南芥逡逑中克隆出来的邋ＮＡＣ邋基因邋ＮＡＭ邋（Ｎｏ邋Ａｐｉｃａｌ邋Ｍｅｒｉｓｔｅｍ）邋［７］，ＡＴＡＦ１／２邋（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉａｎａ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）和邋ＣＵＣ２邋（ｃｕｐ－ｓｈａｐｅｄ邋ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）邋［８］。他们所编码的蛋白质，Ｎ邋端结逡逑氨基酸序列都高度保守且具有较高的同源性。逡逑ＮＡＣ转录因子结构特点逡逑典型的ＮＡＣ转录因子蛋白具模块化组织，通常由高度保守的Ｎ端结构域和一个可高的Ｃ端转录调节域组成。Ｎ端结构域一般包含１５０个氨基酸，能够再次细分为５个逡逑构域（Ａ－Ｅ）［９］。在５个亚结构域中，核定位作用以及参与ＤＮＡ结合的功能主要由Ａ、逡逑保守性较氋的亚结构域负责；Ｂ、Ｅ这两个亚结构域与生长发育期的调控和植物组织逡逑性等有关，是ＮＡＣ转录因子功能多样性决定性区域，所以保守性较低，具有发散性。逡逑蛋白Ｃ端具有高度特异性，是转录激活功能区，能起到转录激活或转录抑制作用逡逑Ａ邋．邋．．邋．．逦．．．逦．逦Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，邋ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，逡逑ＤＮＡ／ｐｒｏｔｅｔｎ邋ｂｍｄ．ｎｇ／ｄｉｍｅｎｚａｔｉｏｎ

生物胁迫,病原体,拟南芥,示意图

共同调控角果成熟，并在角果细胞的程序化死亡过程扮演主要角色［１８］。逡逑１．３．２参与非生物胁迫逡逑关于ＮＡＣＴＦｓ在非生物胁迫中的功能，前人己做了深入研究（图２）。在拟南芥中，逡逑通过对和ａｔｏ／７－２突变体［１９１以及ＡＴＡＦ１转基因过表达植株的研究［２Ｇ］，我们可知逡逑ＡＴＡＦ１在干旱胁迫中既可能是正调控也可能是负调控，这可能是由于ＮＡＣ基因在拟南芥逡逑中功能冗余造成的［１９，２１］。植物激素ＡＢＡ、干旱胁迫、高温胁迫都能诱导ＡＮＡＣ０５５和逡逑ＡＮＡＣ１９，这两个转录因子可以和脱水诱导早期应答基因ＥＲＤ１启动子特异结合，进一步逡逑过量表达和能够诱导下游抗旱相关靶基因的表达，从而提高拟南芥的逡逑抗旱性［２２］。拟南芥中ＮＡＣ家族的另一个转录因子ＮＡＣ０１６，可以与下游靶基因兄？的逡逑启动子结合，抑制」及五５７表达番茄中过量表达基因，能够诱导低温胁迫相关基逡逑因的表达

病原体,转录因子,病原物,侵染

１．３．３参与生物胁迫逡逑大量研宄报道ＮＡＣＴＦｓ在针对不同病原体调控植物防御反应方面也具有重要作用。如逡逑图３所示ＮＡＣ转录因子作为应对生物胁迫转录调控的关键组分，调控植物防御反应。逡逑ＮＡＣ蛋白可通过植物激素信号途径激活抗病相关基因（Ｐｉ？），通过在感染部位诱导超逡逑敏反应（ＨＲ）使细胞程序性死亡，来调节植物防御反应［２８，２９】。研宄表明，ＮＡＣ基因在参与逡逑植物不同的激素信号传导途径中发挥不同的调节作用。拟南芥中可以被植物激素逡逑ＪＡ、ＳＡ诱导表达，而ＪＡ、ＳＡ是植物抗病防御途径的关键激素。过量表达ＪＺ４Ｆ２会使拟逡逑南芥中抗病相关基因表达下调，对病原真菌的抵抗力明显下降，这说逡逑明在抗病反应中起负调节作用［３（）Ｕ水稻稻瘟病菌能够诱导ＣＷ＼＾Ｃ＜５的表达，逡逑ＯｓＡ＾ａ？与拟南芥亲缘关系密切。此外还发现，在转基因的水稻中稻瘟病逡逑菌入侵速度大大减缓，水稻抗稻瘟病的能力显著上升［２５］。ＣＷＶ＾Ｃ７９基因可以被茉莉酸甲酯逡逑（ＭｅＪＡ）、脱落酸（ＡＢＡ）、乙烯（ＥＴ）等诱导表达

【相似文献】