黄单胞菌HarpinX蛋白耐热机制的初步研究

发布时间：2020-09-08 11:41

　　 Harpin蛋白是由hrp基因编码的抗病激活蛋白,也是一种耐热蛋白,通过革兰氏阴性植物病原细菌Ⅲ型泌出系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌,既能诱导非寄主植物产生过敏性坏死反应(Hypersensitive response,HR),同时其本身又是病原菌的一种致病因子。目前国内外对Harpin蛋白的作用机制已有深入研究,但对于它的耐热机制尚未见专门的研究报道。为了研究HarpinX的耐热机制,本研究以来自黄单胞菌的HpaXm、Hpa1Xoo、HpaXam和HpaXcm为材料,利用生物信息学技术深入分析了蛋白结构特征;通过烟草叶片表型试验和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,从表观和微观两方面探索了高温对蛋白功能的影响;通过检测蛋白吸光度和圆二色(Circular dichroism,CD)光谱,探究了高温对蛋白结构的影响:利用定点突变技术对蛋白coiled-coil(CC)结构进行改造,验证了 CC结构与蛋白热稳定性的关系。主要研究结果如下:1.通过烟草叶片HR表型试验分析比较4种HarpinX蛋白的热稳定性,发现高温对Hpa1Xoo和HpaXcm的HR活性影响不明显,说明热稳定性较好;高温使得HpaXm和HpaXam的HR活性明显下降,说明热稳定性较差。2.通过检测蛋白吸光度,发现HarpinX吸光度随处理温度的增加而上升,推测高温使包埋在结构内部的苯丙氨酸逐渐暴露,蛋白结构逐渐展开。通过CD光谱检测二级结构含量,发现高温处理后HarpinX的α-螺旋含量增加至接近100%。进一步证实高温使HarpinX的蛋白结构发生变化,促进其他二级结构向α-螺旋转化。3.通过表型试验发现,HarpinX的HR活性随高温变化不明显。利用qRT-PCR对NtEXP6、Hin1、HSR203J、NPR1、PR-1a表达情况进行检测,发现高温使各基因表达量发生了不同程度的变化。推测HarpinX的耐热性与蛋白空间结构关系微弱,但蛋白诱导基因表达的能力与蛋白空间结构关系密切。4.利用生物信息学对蛋白进行分析,发现在HarpinX蛋白N末端的α-螺旋区域都能够形成CC结构,但形成的可能性各有不同。利用定点突变技术改造CC结构,成功获得突变体 HpaXmAL39A、HpaXmAD40A、Hpa1XooAL40A、Hpa1Xoo△D41A、HpaXam△L44A、HpaXamAM54L、HpaXcmAL40A 和 HpaXcmAD41A。通过 Western blot发现,HpaXam的Leu44对蛋白可溶性表达至关重要。结合CC结构预测结果发现,若破坏CC的形成,相应突变体的热稳定性随之变弱;反之,若加强CC的形成,相应突变体的热稳定性随之增强。5.综合以上结果推测,高温使HarpinX的空间结构逐渐展开,但蛋白的HR活性具有耐热性,可能是由于高温无法破坏蛋白的氨基酸序列,所以序列中heptad的关键氨基酸仍能够通过疏水作用力形成CC结构,因此高温处理后的HarpinX蛋白仍然能与烟草叶片中的互作蛋白进行互作,从而产生HR坏死斑。对HarpinX蛋白的耐热机制进行初探,不仅为深入研究Harpin蛋白的作用机理奠定基础,也为改造工业上非耐热蛋白提供理论依据。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S432.1
【部分图文】：

旋相互作用模型示意图（石刘飞，２０ｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａ－ｈｅｌｉｃｅｓ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ体；Ｂ：三聚体；Ｃ：四聚体；Ｄ：ｅｒ；邋Ｂ：邋Ｔｒｉｍｅｒ；邋Ｃ：邋Ｔｅｔｒａｍｅｒ；邋Ｄ：邋Ｈｅｘａ一个单体，ａｂｃｄｒｆｇ为ｈｅｐｔａｄ邋ｒｅｐｅａｔｒｅｓｅｎｔｓ邋ａ邋ｓｉｎｇｌｅ，邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｗ构特征，随着研究的不断深入，面。利用ＣＣ结构结合亲和层析用Ｅ３／Ｋ３的ＣＣ结构来共纯２０１２）。目前，根据此原理己经方面，利用ＣＣ结构进行药物的实现药物缓释效果，避免药物对上识别到活性蛋白和受体（Ｌｅｅｔａｌ．加以运用，Ｃｈａｏ等人设计合成的

图７邋ＨａｒｐｉｎＸ蛋白ｃｏＨｅｄ－ｃｏｉｌ结构的预测逡逑Ｆｉｇ．７邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨａｒｐｉｎＸ逡逑．１．５邋ＨａｒｐｉｎＸ蛋白的三级结构预测逡逑三维结构模型表明，ＨａｒｐｉｎＸ的结构中均有两个主要的ａ－螺旋（图８）ｅｕ４２、Ｌｅｕ４６邋和邋Ａｌａ４９邋是形成邋ＨｐａＸｍ邋中邋ＣＣ邋结构的关键氨基酸，Ｌｅｕ４０、ＬｅＡｌａ５０是形成ＨｐａｌＸｏｏ中ＣＣ结构的关键氨基酸，Ｌｅｕ４４、Ｌｅｕ４７、Ｌｅｕ５１形成ＨｐａＸａｍ中ＣＣ结构的关键氨基酸，Ｌｅｕ４０、Ｌｅｕ４３、Ｌｅｕ４７和ＡｌａｐａＸｃｍ中ＣＣ结构的关键氨基酸（图８），而这些氨基酸都位于心螺旋的）0逡逑

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【参考文献】

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1 纪兆林;李健;石刘飞;郝欣;王金生;;水稻白叶枯病菌Hpa1_(Xoo)蛋白的结构分析[J];植物病理学报;2014年05期

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3 徐刚;姚银安;;水杨酸、茉莉酸和乙烯介导的防卫信号途径相互作用的研究进展[J];生物学杂志;2009年01期

4 石宣明,刘淑珍,黄玉碧;嗜热酶耐热机制的研究进展[J];科学技术与工程;2004年09期

5 沈星灿,梁宏,何锡文,王新省;圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展[J];分析化学;2004年03期

6 张伟玉,杨静慧,刘玉冬,柳树梧,罗云波,刘艳军;水杨酸对NR基因的表达和乙烯信号转导的影响[J];西南农业大学学报(自然科学版);2003年03期

7 闻伟刚,王金生;水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达[J];植物病理学报;2001年04期

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3 丁亚燕;Hpa1_(Xoo)-N21多肽的应用及其胁迫下抗病机制研究[D];扬州大学;2017年

4 郝欣;转hpa1_(Xoo)-N21基因烟草三种抗病信号通路相关基因研究[D];扬州大学;2016年

5 石刘飞;卷曲螺旋Hpa1_(Xoo)-N21多肽在烟草中的受体分析[D];扬州大学;2015年

6 张阳;丁香假单胞大豆致病变种harpin蛋白HrpZ_(PsgS1)抗病和促生功能域及转录组研究[D];南京农业大学;2015年

7 吴少峰;耐高温铁超氧化物歧化酶的表达纯化及其结构研究[D];浙江理工大学;2012年

8 李明勇;极细链格孢菌激活蛋白PeaT1结构域分析与功能研究[D];中国农业科学院;2008年

本文编号：2814136