杂交构树UDP-葡萄糖脱氢酶基因的克隆及特性分析

发布时间：2020-09-08 12:50

　　架杂交构树(Broussonetiakazinoki ×Broussonetiapapyifera)被广泛应用于造纸、饲料、医药等行业,并在扶贫产业、环境保护,生态修复上发挥重要作用。在高等植物中,多糖代谢在调控纤维素、半纤维素、果胶和胼胝质等细胞壁物质的形成、营养器官的生长及生殖器官的发育过程发挥重要作用。尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UGDH)是半纤维素和果胶生物合成途径中的关键酶,其以NAD+为辅酶催化UDP-葡萄糖转化为UDP-葡萄糖醛酸酯(UDP-GlcA),进而参与植物生长发育的调控。因此,研究杂交构树UGDH基因的功能和表达特性对于该多功能综合性树种的开发利用具有重要意义。本研究从杂交构树中分离UGDH基因及其启动子,并分析BpUGDH的表达模式及功能,同时对低温胁迫和正常生长的杂交构树组织培养苗,进行转录组测序分析,对获得的差异表达基因进行功能注释与归类,构建蛋白质互作网络。旨在提高杂交构树的生长发育和适应性,拓展其栽培区域,并为杂交构树的分子育种提供耐寒性的候选基因。主要结果如下:(1)利用兼并-PCR及RACE技术克隆分离了杂交构树UGDH基因,命名为BpUGDH。BpUGDH基因cDNA包含1443bp的开放阅读框,编码480个氨基酸,其蛋白分子量为53.04kDa,理论等电点为5.98;BpUGDH与苎麻的UGDH亲缘关系较近,定位于叶绿体中。(2)利用Real time Q-PCR技术对BpUGDH基因的表达模式进行调查结果显示,BpUGDH基因在杂交构树的根、茎和叶中均能稳定的表达,且茎中的表达量最高。(3)利用Genome Walking技术从杂交构树基因组中分离了1324bp的BpUGDH基因启动子,利用GUS报告基因深入分析了BpUGDH的表达模式发现,Pro.BpUGDH::GUS在转基因拟南芥幼苗及生长旺盛组织中高效表达,在成熟组织中表达量明显下降,种子中没有检测到该基因的表达。激素诱导和低温胁迫实验证实,Pro.BpUGDH::GUS的表达受乙烯、赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯和低温的诱导。(4)利用同源重组方法构建pBI101-BpUGDH双元表达载体,通过农杆菌介导的花絮浸染法遗传转化拟南芥,分析BpUGDH基因的功能。结果显示:BpUGDH基因在拟南芥中的过量表达增加了转基因株系体内可溶性糖的含量,促进了半纤维素和果胶的积累,提高了转基因拟南芥的营养生长,并且四个转基因株系均表现出更强的耐寒能力。(5)杂交构树组培苗进行转录组测序共获得59056条unigenes。通过BLAST软件与常用的6大数据库进行比对分析,结果在NR数据库31358个unigenes有比对结果且与川桑(Morus notabilis)的相似数为最多,达到了60.40%;在Swiss-Prot、Pfam、COG、GO、KEGG 数据库中分别 27426、23431、7957、18183、15574 个 unigenes有比对结果。(6)低温胁迫下杂交构树中筛选出7320个差异unigenes,其中上调表达基因3219个,下调表达基因4101个。差异表达基因的GO功能注释结果显示,催化活性、代谢进程、膜活性、结合活性、细胞进程、单生物进程和覆膜部分中涉及的unigenes较多;1552个基因被注释到KEGG数据库,涉及的通路有124个,富集通路主要集中在新陈代谢部分。(7)利用String 11.0数据库的拟南芥蛋白质互作网络数据为参考,进行差异表达基因的蛋白PPIs预测,筛选出PCNA2、THY-1、DUT1和CDC2等四个互作度较高的蛋白;采用同样的方法从BpUGDH基因功能富集获得的3个基因集中,共筛选出47个基因并进行蛋白互作预测获得了与其具有紧密、相互作用的9个蛋白,并结合转录组测序结果初步探讨了BpUGDH基因提高植物耐寒性机制。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S792.99;Q943.2
【部分图文】：

原理图,原理图,反应体系,组分

图３邋５ＷＡＣＥ反应的原理图逡逑Ｆｒｉｇ．邋３邋Ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋５＇－ＲＡＣＥ邋ｒｅａｃｔｉｏｎｓ逡逑ａ．邋ＢｐＵＧＤＨ邋５＇－ＲＡＣＥ邋ＰＣＲ邋ＧｆｌｊＣ邋ＰＣＲ）逡逑１邋ｓｔ邋ＰＣＲ扩增反应：按及８所示休积配制ＰＣＲ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ。额外多加？个反量，以保证有足够的休积。逡逑表８邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ反应体系逡逑Ｔａｂｌｅ．Ｘ邋Ｔｈｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｆｏｒ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ逡逑ｏｍｐｏｎｅｎｔ逦Ｖｏｌｕｍｅ邋（ｕＬ）ＣＲ－Ｇｒａｄｅ邋Ｈ：０逦１５．５逡逑ｘＳｅｑＡｍｐ邋Ｂｕｆｆｅｒ逦２５．０逡逑ｅｑＡｍｐ邋ＤＮＡ邋Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ逦１．０逡逑ｏｔａｌ逦４Ｌ５按Ｋｌｆｌ丨顺抒把各组分加入到０．５邋ｍｌ邋ＰＣＲ邋ｔｕｂｅｓ中，轻柔混６ｊ，邋ｌｉｌ制ＰＣＲ反丨、Ｖ：液°°°°

原理图,原理图,反应体,反应条件

图４邋３ＶＡＣＥ反应的原理图逡逑Ｆｉｇ．４邋Ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋３＇－ＲＡＣＥ邋ｒｅａｃｔｉｏｎｓ逡逑ＰＣＲ扩增反应：配制ＰＣＲ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ同５＇－ＲＡＣＥ邋ＰＣＲ反应。反应体ＰＣＲ邋反应条件为：９４°Ｃ邋３ｍｉｎ；邋９４°Ｃ邋３０ｓ，６８°Ｃ邋３０ｓ，邋７２°Ｃ邋ｌｍｉｎ，２５邋ｉｎ作为eA终延伸。逡逑表１１邋ｙ－ＲＡＣＥ邋１ｓｔ邋ＰＣＲ扩增反应体系逡逑Ｔａｂｌｅ．邋１１邋Ｔｈｅ邋ｆｉｒｓｔ－ＰＣＲ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｆｏｒ邋３＇－ＲＡＣＥ逡逑ｎｔ逦Ｖｏｌｕｍｅ邋（ｕＬ）－Ｒｅａｄｙ邋ｃＤＮＡ逦１．５逡逑５．０逡逑１邋（１０｜ｉＭ）逦２．０逡逑ｉｘ邋（Ｓｔｅｐ邋１）逦４１．５逡逑５００邋ＰＣＲ扩增反应：将１ｓｔ邋ＰＣＲ产物稀释５０倍，代替２ｎｄ邋ＰＣＲ扩枘反

电泳图,反应产物,电泳图,末端序列

以杂交构树叶片总ＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ为模板，利用克隆兴安落叶松Ｌｇｔ／ＧＤ／／／逡逑基因的兼并引物进行巢式ＰＣＲ反应。经两次兼并ＰＣＲ扩增获得的产物经１．０％琼脂逡逑糖凝胶电泳分离，结果见图６。由此可见，第二轮兼并ＰＣＲ扩增出一条明亮的７５０ｂｐ逡逑左右的特异条带；将该扩增产物进行回收、与ＰＭＤ１９－Ｔ载体连接及转化大肠杆菌；逡逑对鉴定为阳性的菌落进行扩培、测序，获得了邋７５２ｂｐ的序列。通过ＮＣＢ丨的Ｂｌａｓｔ邋Ｘ逡逑在线软件进行分析的结果显示与其他植物的同源性在８５％以上推测其为基逡逑因ｃＤＮＡ片段。逡逑ｉｏｏ0ｂｐ邋ＭｓＢ逡逑■逡逑图６兼并ＰＣＲ反应产物电泳图逡逑Ｆｉｇ．６邋Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ邋ＰＣＲ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑注：Ｍ为２００ｂｐ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋１为第二次ＰＣＲ产物，２为第一次ＰＣＲ产物，逡逑２．３．１．２克隆基因末端序列逡逑通过５Ｖ３’邋ＲＡＣＥ－ＰＣＲ扩增获得卸ｔ／ＧＤ／／基因的末端序列，分别为：７８９ｂｐ的逡逑３’末端序列（图７）和６７２ｂｐ的５＇末端序列（图８）。利用ＮＣＢＩ的Ｂｌａｓｔ邋Ｘ在线软件逡逑对测序获得的序列进行比对分析发现，与番木瓜、接子（Ｃ／７ｍｖ逡逑ｉ’／／乻访）、核桃、葡萄（ｒ／ｔｏｖ／ｗ／ｙ＾ｒａ）等其他物种的ｔ７ＧＺ）／／基因逡逑

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