水稻硫酸转移酶（OsSOT1）的原核表达、纯化与酶活测定
发布时间：2020-09-08 20:47
硫酸转移酶(Sulphotransferase,SOTs)是一类在动植物及微生物中高度保守的蛋白家族,催化磺基(SO_3~-)转移至含氨基或羟基的底物,在细胞内具有重要的生理学功能。目前,SOTs一般通过原核表达并利用亲和层析法纯化,采用同位素法、吸光值法等测定酶的动力学常数,结合体外酶活测定结果与生理数据分析其在生物体内的具体生物学功能。但该体系存在着一些不足和待解决的问题,如:纯化蛋白浓度低且纯度不高、PAPS作为通用底物昂贵且易分解、酶学测定操作复杂和耗时等。本研究初步探讨了解决这些问题的方法。利用已知基因AtSOT12(At2g03760)在Oryza sativa Indica Group基因库中同源比对,得到同源性最高的OsSOT,通过与报道的序列比对表明其为OsSOT1。依据最新命名法,可将OsSOT1与AtSOT12归为一个家族,暗示两者在结构与功能上的相似性。目前已报道了一部分拟南芥及人SOTs的酶学信息,但对水稻SOTs分析只停留在基因和生理学信息上。由此开展以下方面的工作。探索不同标签及表达条件解决AtSOT12及OsSOT1表达过程中易形成包涵体的问题,结果表明,在LB培养基中增加NaCl浓度至0.2-0.4 M,可降低包涵体的形成;采用MBP作为融合标签可显著增加融合蛋白的可溶性,但不利于标签的去除;采用6His及GST双标签可纯化出较高纯度的蛋白样品。采用多酶反应体系合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS),并探讨了最佳合成条件。结果表明,最适合成条件为pH 8-8.5,温度35℃,加入PK及PEP可增加PAPS的合成率(90%);利用强阴离子交换柱纯化分离PAPS的结果表明,选择KCl溶液(pH 4.5)进行梯度洗脱(200-500 mM)可纯化得到高浓度、高纯度PAPS,但在纯化过程中可能有PAPS的降解。依据3’,5’-二磷酸核苷酸酶(Hal2)突变体G236V对PAP亲和力为PAPS的5592倍这一特性,建立了由G236V/肌激酶/丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(G236V/MK/PK/LDH)构成的硫酸转移酶偶联酶检测体系。利用该体系测定了AtSOT12催化不同底物的活性,与相关报道结果进行比较发现,所测K_m值相近但kcat较大,可能因为溶剂乙醇对所建立体系的影响,也可能是本次反应体系加入了甘油(由于底物为脂溶性,加入甘油可能促进了反应),加入了足量的PAPS,蛋白纯度高等。利用该体系探索OsSOT1的一些底物,结果表明,OsSOT1能催化某些植物激素,如水杨酸(K_m=360.94μM)、24-表油菜素内酯(K_m=5.83μM),也能催化5-羟基吲哚乙酸、孕烯醇酮及去氢表雄酮等。综上述,本课题初步系统的构建了检测硫酸转移酶酶学信息体系,并测定了未报道的OsSOT1的一些底物酶学信息,建立了高通量、便捷、安全的SOTs活性检测体系,对水稻及其他特定硫酸转移酶的研究有一定基础性意义。
【学位单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q946.5
【部分图文】：
化反应示意图。ST 为 SOTs，催化红色磺酸基团到子；X=O 时，称 SOT 为 O-SOT；X=NH/NR 时，水稻及拟南芥等都鉴定出了许多 SULTs（表T9 基因被鉴定及表征[4]。在动物中，细胞质
1 与黑芥子苷（洋红色棒状）和 PAP（青色棒状）结合的区域 I：蓝色;区域 II：黄色;区域 III：品红色：区域 IV区域（黑色），催化残基（红色）和脯氨酸 136（橙色）Ts 氨基酸比对表明，有四个保守区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、合，Ⅰ区域靠近末端（N 端）结合 5’-磷酰硫酸；Ⅱ Lys59，接受反应过程中的质子，在其 C 端的 A[27; 28]。每个酶的底物结合部位在结构上有所差别物的结合。在许多植物 SOTs 中，在区域Ⅲ和Ⅳ聚 Glu（图 1.3）。尽管动植物在重要的结构区异性，如在所有人的 SOTs 中都存在保守序列 K在[26]。此外，细胞质 SOTs 与细胞膜 SOTs 在底胞膜 SOTs 底物结合位点一般是一个大的开放裂子的 5’-磷酸，而胞质 SOTs 底物结合位点是较深的
图 4.4 SOT 基因构入 pHND 示意图电泳结果表明，经常规诱导，Hal2 标签表达 SOT 融合蛋白时，有蛋白在破碎沉淀中（图 4.5A/B 中条带 3），在洗脱液中目的蛋白含量少A/B 中条带 9 箭头指示），无法进行切除标签。A B图 4.5 Hal2 标签纯化 Hal2-AtSOT12(A)和 Hal2-OsSOT(B)蛋白电泳图。（M. 蛋白1. 诱导前，2. 诱导后，3. 离心沉淀，4. 离心上清，5.上样，6. 裂解液洗涤，7. 8. 洗涤，9. 蛋白洗脱）
本文编号：2814618
【学位单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q946.5
【部分图文】：
化反应示意图。ST 为 SOTs，催化红色磺酸基团到子；X=O 时，称 SOT 为 O-SOT；X=NH/NR 时，水稻及拟南芥等都鉴定出了许多 SULTs（表T9 基因被鉴定及表征[4]。在动物中，细胞质
1 与黑芥子苷（洋红色棒状）和 PAP（青色棒状）结合的区域 I：蓝色;区域 II：黄色;区域 III：品红色：区域 IV区域（黑色），催化残基（红色）和脯氨酸 136（橙色）Ts 氨基酸比对表明，有四个保守区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、合，Ⅰ区域靠近末端（N 端）结合 5’-磷酰硫酸；Ⅱ Lys59，接受反应过程中的质子，在其 C 端的 A[27; 28]。每个酶的底物结合部位在结构上有所差别物的结合。在许多植物 SOTs 中，在区域Ⅲ和Ⅳ聚 Glu（图 1.3）。尽管动植物在重要的结构区异性，如在所有人的 SOTs 中都存在保守序列 K在[26]。此外，细胞质 SOTs 与细胞膜 SOTs 在底胞膜 SOTs 底物结合位点一般是一个大的开放裂子的 5’-磷酸，而胞质 SOTs 底物结合位点是较深的
图 4.4 SOT 基因构入 pHND 示意图电泳结果表明，经常规诱导，Hal2 标签表达 SOT 融合蛋白时，有蛋白在破碎沉淀中（图 4.5A/B 中条带 3），在洗脱液中目的蛋白含量少A/B 中条带 9 箭头指示），无法进行切除标签。A B图 4.5 Hal2 标签纯化 Hal2-AtSOT12(A)和 Hal2-OsSOT(B)蛋白电泳图。（M. 蛋白1. 诱导前，2. 诱导后，3. 离心沉淀，4. 离心上清，5.上样，6. 裂解液洗涤，7. 8. 洗涤，9. 蛋白洗脱）
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1 周宏飞;水稻硫酸转移酶（OsSOT1）的原核表达、纯化与酶活测定[D];浙江师范大学;2019年
本文编号：2814618
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2814618.html
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