CHO细胞表达rhFSH放大工艺研究

发布时间：2020-09-08 20:22

　　人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是人的垂体前叶嗜碱性细胞合成并分泌的一种糖蛋白类促性腺激素~([3])。其家族成员包括促黄体激素,甲状腺激素,人绒毛膜促性腺激素等糖蛋白激素,它们都采用了与人促卵泡刺激素相类似的结构,即共享同样的α-亚基,而β-亚基则随着特异性的不同而不同。人促卵泡激素在人类生殖领域演着重要的角色,它负责调控人体的生长、发育、青春期性成熟等相关的一系列的生理过程。在女性体内,人促卵泡激素可以促进卵泡细胞的增生分化,并促进卵巢生长发育,最终刺激生殖细胞的成熟;在男性体内,人促卵泡激素的作用是促进精子的成熟与形成。由此可见,人促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一,如果正常女性人促卵泡激素分泌偏低,会导致卵子排出异常,从而引起月经不调、卵泡发育不良、不排卵等一系列疾病,最终导致不孕不育的发生。对于促卵泡激素的补充剂,由于其来源不同可分为三大类,第一类是通过下丘脑垂体的提取而得到的FSH,简称为垂体FSH;第二类是从更年期或绝经期妇女尿液中提取出来而得倒的FSH,简称为尿源FSH;第三类是通过重组基因技术,将人促卵泡激素的α-和β-链的编码序列插入真核高表达载体pON1。经DNA序列分析,所获得的α-和β-链的基因组DNA序列在去除内含子序列以后推导的氨基酸序列,与天然的FSH的α-和β-链的氨基酸序列完全一致。再通过悬浮细胞培养技术得到的高纯度FSH,简称为重组人促卵泡激素(rhFSH)。这三类补充剂各有优缺点,其中垂体FSH产量低、价格高,一直不能大范围的应用于临床;尿源FSH由于来源于不同人体,个体差异性大、杂质较大,从而引起患者副作用较大且容易引发过敏等反应一直困扰着医生与患者;因此重组人促卵泡激素凭借着纯度高、特异性强等优点越来越受到患者们的青睐。目前,从国内的重组人促卵泡激素需求上来看,产品主要以进口为主。而国内唯一的“金赛恒”重组人促卵泡激素在2015年上市销售,打破了国内患者对进口药品的依赖,降低了用药成本,其产品质量可靠,建立了药典标准。但从产能上看,目前该工艺为每批30L培养规模,已不能够满足日益扩大的市场需求。本课题主要通过对重组人促卵泡激素细胞培养工艺的研究,将每批30L规模培养工艺放大至每批200L培养规模,放大前后蛋白质量一致,产能提高,满足市场需求,降低生产成本,让广大的患者受益。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q813.11
【部分图文】：

细胞密度,工艺放大

消耗速率越快。为了保证细胞的可持续生长，因此放大实验不同工艺步骤均采用（0.4~0.6）×106cells/ml 作为接种密度较为合理。3.2 工艺放大实验根据工艺放大设计，对放大后的工艺进行实验生产，对比工艺放大前后的细胞密度、活力、葡萄糖、蛋白表达量及 IEF simple western 等参数，确定工艺放大设计的可行性。重组人促卵泡激素细胞培养工艺中，细胞复苏、扩增的目的是为细胞发酵培养出足够数量的细胞，因此实验过程对于细胞复苏与扩增的数据不作对比。3.2.1 细胞密度对比曲线根据实验结果，与原工艺对比细胞发酵过程中每天的细胞密度数据，结果如图 3.2 所示。

细胞活力

通过对反应器的对比可知前期 200L 不锈钢反应器的搅拌直径较大，对细胞的剪切力较大，因此细胞适应此环境需要一定的时间，而后期 5L 反应器的搅拌速度较小，气体交换不充分，营养物质分布不均一，因此原工艺后期细胞密度上升受阻，而放大后工艺可避免此现象发生。3.2.2 细胞活力对比曲线根据实验结果，与原工艺对比细胞发酵过程中每天的细胞活力数据，结果如图 3.3 所示。

葡萄糖含量

图 3.4 葡萄糖含量对比根据图中葡萄糖的含量分析，放大后的工艺葡萄糖消耗速率稳定，培养基及葡萄糖能够提供细胞足够的营养成分以及碳源、氮源等必要的氨基酸成分，残留葡萄糖的浓度在历史值中心，向上及向下可浮动空间较大，对于工艺控制较为简便，不会因葡萄糖含量不足产生对细胞的损伤。3.2.4 表达量对比曲线根据实验结果，与原工艺对比细胞发酵过程中每天的蛋白表达量数据，结果如图 3.5 所示。

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