黄曲霉调控因子LaeB及孢子色素合成基因pks1功能的鉴定

发布时间：2020-09-15 15:54

　　黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种十分常见的腐生土壤真菌,是导致油料作物和粮食霉变的重要元凶之一,对国家农业经济发展和世界粮食贮存造成了巨大的损失。黄曲霉也是强毒性致癌物质黄曲霉毒素的主要产生真菌,黄曲霉毒素能引发人类和动物中毒甚至肝癌等病症,对人类的健康带来了极大的威胁。已知发现全局性调控因子和分生孢子色素对真菌的生长发育与次级代谢都有着重要的作用。本研究旨在探索黄曲霉全局调控因子和分生孢子色素合成基因对黄曲霉生长发育及次级代谢的影响。本研究中对黄曲霉中的laeB基因进行了敲除,并通过laeB基因缺失菌株(ΔlaeB)与野生型菌株对比发现:laeB缺失菌株表现出生长速率减缓、分生孢子产量增加、菌核的产生受到抑制等多种表型缺陷;而且多种次级代谢产物的产生受到调控,特别是黄曲霉毒素B_1的产量显著减少,对玉米和花生致病能力明显下降。通过基因组数据挖掘和序列比对鉴定了黄曲霉分生孢子色素的合成基因及其基因簇,确认分生孢子色素合成骨架基因pks1缺失菌株(Δpks1)因无法合成分生孢子色素而呈现白色,导致孢子对紫外线照射的抵御能力明显减弱,降低了黄曲霉对玉米和花生种子的侵染能力。而黄曲霉的生长速度、孢子产量、菌核形成和黄曲霉素B_1产生则没有显著性变化,也不影响细胞壁完整性、水活度变化和响应氧化胁迫。综上所述,本研究发现了新型全局性调控因子LaeB对于黄曲霉的生长发育、次级代谢和致病性等方面具有调控作用,分生孢子色素基因pks1则影响黄曲霉分生孢子对紫外线照射等不利环境因子的抵抗能力和对粮食种子的侵染能力。本研究的结果对于进一步研究黄曲霉的生长发育、次级代谢调控和对作物的致病性提供了理论基础,同时对黄曲霉毒素污染的防治和新型农药的开发有着重要的意义。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q933
【部分图文】：

黄曲霉毒素,化学结构,黄曲霉

引言的身体健康和生命安全。1.1.2 黄曲霉毒素及其危害真菌毒素是真菌在生长过程中所产生的次级代谢产物，其具有生物水平累积效果，导致其能被携带到动物体液，器官和组织中，最后使动物中毒甚至死亡[15]。在生活中最常见的真菌毒素是黄曲霉毒素，它主要是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的一类具有强毒性和强致癌性的二氢呋喃香豆素衍生物。目前已经鉴定确认的黄曲霉毒素有 28 种，它们具有较为类似的化学结构，其中最为主要的有 4 种：AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2（如图 1-1）[2, 16]。黄曲霉根据菌核直径大小可以分为 L 型（大于 400 m）和 S 型（小于 400 m），其中 L 型黄曲霉只能产生 AFB1和 AFB2两种黄曲霉毒素，而 S 型黄曲霉能产生 AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2四种黄曲霉毒素[17, 18]。

系统进化关系,同源蛋白,真菌

图 2-1 不同真菌中 PKS1 同源蛋白的系统进化关系分析。Figure 2-1. Phylogenetic analysis of PKS1 homologous protein from different fungi.然后利用 antiSMASH 在线分析预测黄曲霉 pks1 基因所在基因簇，获得预测的黄曲霉分生孢子色素合成基因簇基因类型及结构。通过与米曲霉、黑曲霉和构巢曲霉等 5 个菌种同源基因簇分析比对，发现该基因簇与米曲霉同源基因簇高度保守，且合成骨架基因 pks1 有 99%的相似度，与黑曲霉 albA（ANI_1_726084）、烟曲霉 alb1（AFUA_2G17600）和构巢曲霉 wA（AN8209）三个黑色素生物合成基因相似性均在 73%以上，但与非曲霉属的真菌无花果拟盘多毛孢的黑色素生物合成骨架基因 PfmaE（PFICI_07101）的相似性仅为 44%（图 2-2 和附表 1）。上述结果分析可得，黄曲霉分生孢子色素合成途径应类似于黑色素的 DHN 合成途径。

黄曲霉,基因簇,分生孢子,同源性

图 2-2 黄曲霉分生孢子色素合成基因 pks1 基因簇的同源性比对Figure 2-2. Homologue alignment of pks1 cluster in A. flavus.2.3.2 黄曲霉分生孢子色素合成基因 pks1 敲除菌株的构建与验证利用通过生物信息学分析，确认了分生孢子色素合成骨架基因为 pks1。本研究利用同源重组替换的方式敲除目标基因，获得敲除菌株 Δpks1，通过与野生型菌株分析对比两者差异性。敲除原理如图 2-3A 所示，本实验使用 double-joint技术手段获得用于同源重组的融合片段[98]。通过 PEG 介导的原生质体转化方法将融合片段导入到黄曲霉 CA14 PTs 中。之后利用 pyrG 标记初步筛选转化子，多次筛选后，提取转化子基因组 DNA 使用三对引物筛选正确的转化子。因引物位于目标基因内部，扩增出条带 P1 则能证明目的基因未能敲除成功。之再使用引物进一步扩增条带 P2 和 P3，能确认转化子成功敲除目标基因。如图 2-3B 所示，转化子无法扩增出条带 P1，能扩增出目标条带 P2 和 P3，证明转化子是阳性转化子，而野生型则与之相反。PCR 结果图所示获得 3 个阳性转化子并用于后续试验研究。

【相似文献】