Tca-miR-375-3P及其靶标Ptdlns-P2-Ptase调控赤拟谷盗羽化和生殖的功能研究

发布时间：2020-09-15 17:34

　　 昆虫的变态发育是昆虫与环境长期适应、协同进化的结果,受激素、营养和基因的精确调控,在此过程中有多重因子协同发挥作用。近年来,非编码小分子RNA(microRNA)在昆虫中的研究表明,其对昆虫的变态发育具有显著的调控作用。但在模式昆虫赤拟谷盗中,对microRNA参与发育事件的研究仍鲜有报道,对其具体的调控机制也需要进一步阐明。本论文中利用miRNA类似物、双荧光素酶报告实验、双链干扰以及解剖学观察等实验手段对miR-375-3p及其靶基因Ptdlns-P2-Ptase进行了功能分析,并对其在赤拟谷盗中的作用机制有了一个初步探讨。首先,通过注射miR-375-3p类似物上调其表达进而探讨其在蛹到成虫的调控作用。miR-375-3p类似物处理组跟对照组比,处理晚期蛹组阻碍了蛹到成虫的发育过程,并引起致死效应,顺利羽化为成虫后也存在羽化缺陷;顺利进入成虫期后发现,与对照组相比,成虫产卵量下降,且解剖后发现卵巢发育有缺陷,卵巢管受精卵的数量明显少于对照组。其次,为研究miR-375-3p对赤拟谷盗的变态发育过程中羽化和生殖的调控,使用3个预测软件PicTar,miRanda,Targetscan对miR-375-3p进行靶基因预测,分别得到的结果中选取交集,且按匹配值以及种子序列及结合前期候选靶基因功能研究,最终筛选出3个预测靶基因,它们分别为:Eip63E,Pkn,Ptdlns-P2-Ptase。随即对候选靶基因构建荧光素酶报告基因载体,进行体外验证,结果表明Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p真正的靶基因,跟对照组相比,只有Ptdlns-P2-Ptase的荧光素酶活性下降70%左右。最后,为了进一步探讨miR-375-3p和其靶基因Ptdlns-P2-Ptase对赤拟谷盗发育的调控作用,我们对其靶基因的体内功能进行研究。在晚期蛹进行Ptdlns-P2-Ptase RNAi,显示了与注射miR-375-3p类似物后相似的生物学表型,尽管Ptdlns-P2-Ptase的敲减对赤拟谷盗变态发育的影响更为显著。这些结果进一步证明了Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p的靶基因。与此同时,我们发现注射miR-375-3p类似物和敲减Ptdlns-P2-Ptase时,蜕皮激素通路上的关键基因Br-c,E74,EcR,E93的表达量与对照组相比没有显著差异;与此相对的是,保幼激素通路上的转录因子Kr-h1的表达量明显升高。这些结果表明miR-375-3p和Ptdlns-P2-Ptase都参与调控赤拟谷盗保幼激素通路,从而影响羽化和生殖。综上所述,作为赤拟谷盗在晚期蛹低表达,早期成虫特异高表达的miRNA之一,miR-375-3p调控蛹的正常发育,并参与了赤拟谷盗变态发育中的羽化和生殖过程,证明了时期特异性miRNAs存在潜在的生物学意义。此外,miR-375-3p通过其靶基因Ptdlns-P2-Ptase影响双信使信号通路对保幼激素信号分子的传递效率,从而参与调控赤拟谷盗羽化和生殖过程。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q965
【部分图文】：

移入培养箱中饲养，每天在固定时间观察表型并拍8h 后各取三只进行总 RNA 提取，用以检测干扰效率化的成虫在 5 天后进行雌雄配对，预交配 3 天后，正化情况，统计结束后解剖成虫，观察生殖腺的发育情与分析-3p 在赤拟谷盗不同时期表达模式期通过微流体芯片实验得到 miR-375-3p 在晚期幼虫、达模式，并用荧光定量 PCR 进一步补充了赤拟谷盗八早期成虫特异高表达，而在其他时期相对低表达，成虫暗示 miR-375-3p 在成虫羽化的过程中发挥着重要作用蛹顺利羽化变成成虫。第二章 miR-375-3p 对赤拟谷盗羽化和生殖的影响

以加入特异的 miR-375-3p 逆转录引物得到的 cDNA 作为模板，定量 PCR 检测 miR-375-3p 的表达量。注射 miR-375-3p mimics 后，定量结果显示赤拟谷盗体内miR-375-3p 的表达水平明显上升（图 2.2A），可以对 miR-375-3p 进行获得性研究。2.4.2.2 晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 导致羽化缺陷在晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 后，观察发现蛹不能成功羽化为成虫，而且出现了两种表现，一种是停滞在蛹—成虫的中间形态，随后死亡，此比例占 25%，另一种表型是羽化后翅膀存在缺陷，鞘翅不能合拢，这种比例占到了 35%，还有一部分正常羽化（图 2.2C-D）。晚期蛹注射 miR-375-3pmimics 改变了蛹期到成虫期 miR-375-3p 的表达模式，蛹不能正常羽化，由此我们推测 miR-375-3p 在蛹期低表达，成虫期高表达是使赤拟谷盗羽化阶段所必须的。2.4.2.3 晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 引起生殖缺陷将羽化成功的成虫进行雌雄交配，观察发现跟野生组或者 NC 对照组相比，成虫产卵量下降（图 2.2B），不影响孵化，解剖后发现生殖腺存在发育缺陷（图 2.2E）。这一结果表明，改变 miR-375-3p 的正常表达模式，将影响赤拟谷盗的生殖。

图 3.3 miR-375-3p 与候选靶基因在 3’UTR 区的一个互补位点因双荧光素酶报告检测结果构建靶基因的双荧光素酶报告基因载体进行细胞实验验证序列的报告基因载体，与 miR-375-3p mimics 共转染进黑照组，第一组为实验组：miR-375-3p mimics 、 Pac-pG为对照组：miR-375-3p mimics、Pac-pGL3 空载质粒、PRL的活性，每个 miRNA 与靶基因设置三次技术重复，两次现 Tc002125 荧光值明显下降（图 3.4C），而 TC002523、现显著的下调作用（图 3.4A-B）。为确定 Tc002125 确定计突变基因 Tc002125-mut，进行双荧光实验。设置实验组375-3pmimics、Pac-pGL3 重组质粒、PRL；实验组 2：miR-37t 重组质粒、PRL；对照组：miR-375-3p mimics、Pac-pGL3测荧光素酶的活性，每个 miRNA 与靶基因设置三次技术果如图 3.4D ，确定了 Tc002125 也就是 Ptdlns-P2-Ptase 基

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本文编号：2819262