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自结合肽的折叠—结合耦合机制研究

发布时间:2020-09-27 17:23
   自结合肽(SBP)是一种位于单体蛋白质内部具有独立结构和功能的短肽片段,通过一条柔性连接区域(linker)与母体蛋白其余部分相连,并动态地与该母体蛋白特定区域(靶标)发生可调节的复合和解离(association and disassociation)。这是一种兼具蛋白质折叠(folding)和结合(binding)特征的生物分子现象。众所周知,蛋白质的折叠是新生肽链获得其生物学功能的重要过程。一般来说,该折叠发生在单一多肽链上。对于SBP现象,由于其与靶标区域序列的连续性人们通常很自然地将之归于折叠的范畴,即把它视为单体蛋白折叠事件的最后一步。然而,SBP与传统蛋白质折叠又有显著的差异,如SBP可动态复合/解离以及表现出分子开关功能等,这些都是典型的结合特征。因此,从表观上来看SBP具备折叠和结合的双重特征。为了弄清SBP折叠-结合耦合(coupled folding and binding)的分子机制,本研究对多个典型且具有代表性的SBP单体蛋白进行了系统地分子动力学模拟和热力学分析,包括原癌基因产物Vav、人类视黄酸受体RARγ、果蝇模架蛋白INAD和14-3-3蛋白Cp14b。首先,人工切断了结合状态下SBP的linker区域获得了游离的SBP肽段,并在此基础上构建了人工非结合状态的SBP/靶标复合物体系;进而,分别对SBP游离肽段、人工复合物体系、天然结合体系进行了动力学模拟,并对比分析了不同体系的动力学行为、热力学性质以及相关的焓熵效应。此外,我们还采用原癌基因产物Vav内部SBP结合状态下的天然晶体结构为模板,将其SBP部分与靶标连接的linker区域人为切断,从而搭建了断开的SBP/靶标复合物体系,并对其进行系统的动力学研究,进而对比分析了有无linker区域对SBP结合方式的影响。研究表明:一方面,SBP可以视为经典蛋白质折叠(folding)的一个环节,它通过蛋白质内部分子相互作用而实现与母体蛋白其他部分绑定;另一方面,通过切断linker对比研究发现,SBP/靶标相互作用的热力学性质并不会受到显著影响,因此在分子水平上SBP与普通肽/蛋白质复合物的结合(binding)情况并无本质区别。鉴于此,我们认为SBP是受传统意义上蛋白“折叠”驱使的分子内“结合”现象,可以视为一种新型的折叠-结合耦合行为,即“伴随折叠的结合(binding-upon-folding)”,其与先前人们针对普通肽/蛋白质复合物体系提出的“伴随结合的折叠(folding-upon-binding)”互为反向过程。此外,我们还发现尽管linker区域并不会显著影响SBP/靶标相互作用的热力学性质,但能有效促进SBP与靶标之间的动态接触几率,从而在动力学水平提高二者之间的结合效率,这与普通肽/蛋白质复合物体系的“folding-upon-binding”又有本质区别,因此SBP可视为一类介于折叠和结合之间的新型生物分子现象。我们分析了SBP序列的残基组成倾向,发现它与传统无定型态蛋白(intrinsically disordered protein)中的结构混乱区域的氨基酸组成较为相似,但二者的结构形态和功能实现方式存在较大区别,因此不能将之简单归属于无定型态蛋白之列。
【学位单位】:电子科技大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2019
【中图分类】:Q51
【部分图文】:

示意图,自结合,分子开关,靶标


电子科技大学硕士学位论文与所在单体蛋白中的其他特定区域(靶标)进行动态复合和解离来动态调节该蛋白质的生物学功能。在一个 SBP 系统中,SBP 片段一方面可以特异性地识别其靶标区域并与之相互作用,在复合态和解离态之间建立动态平衡,从而实现 SBP 与靶标的空间独立性;另一方面,该 SBP 又通过一个柔性多肽连接环(linker)与其靶标相连,从而实现二者序列的共享性(见图 1-1[8])。从而使得 SBP 兼具“结合”和“折叠”的特征。

示意图,自结合,区段,靶标


电子科技大学硕士学位论文这四种单体蛋白系统均源于不同物种,它们的三维空间结构以及生物学功能也各不相同。对于四个单体蛋白系统中的 SBP 区段,它们的序列、构象以及结合模式也不尽相同。这使得我们所选样本具有多样性和代表性。这些蛋白的高分辨率结构是通过溶液核磁共振(NMR)或 X 射线晶体学解析得到的。我们从 PDB数据库中获取到的这些蛋白质结构均为天然的 SBP 结合状态(如图 2-1 所示)。

示意图,自结合,结合状态,结构构


第二章 自结合肽的折叠特性其所在的 SBP 区段占据这个蛋白质的肽结合口袋,从而调控 Cp14b 与其天然肽配体之间的复合和解离。2.2.2 自结合肽-靶标非结合状态的人工构建我们所使用的四个 SBP 单体蛋白系统的晶体结构均为结合状态。我们使用了一种经验方法来构建这四个单体蛋白系统的 SBP 非结合状态结构。首先,我们根据基于结构数据及相关文献报告确定了每个系统中 SBP 区段的具体残基序列[7, 8]。然后,如图 2-2 所示,人工切断 SBP 区段与母体蛋白之间的 linker,使得其最邻近的两个残基从母体蛋白脱离下来(a)。接着对每个 SBP 切断的 N 端或 C 端分别用乙酰基(-Ac)和氨基( NH2)进行封端基处理。

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