家蟋蟀翅二型的分子机理研究

发布时间：2020-09-29 11:22

　　翅二型是昆虫种内形态分化的常见现象,广泛存在于双翅目、半翅目、鞘翅目以及直翅目等昆虫类群中,主要包括“天生型翅二型”和“落翅型翅二型”两类。翅型分化是昆虫适应环境变化而产生的生存应对策略,这种形态发育可塑性一直是众多昆虫学者关注的焦点,探究昆虫翅型分化的分子生物学机制可为理解昆虫适应性进化提供科学解释。现有研究多集中在飞虱、蚜虫等“天生型翅二型”的少数昆虫种类中,对于直翅目和“落翅型翅二型”昆虫的研究相对较少,尤其是对“落翅型翅二型”分化的分子调控机制尚无明确解释。家蟋蟀(Acheta domesticus Linnaeus 1758)是直翅目蟋蟀科中的常见鸣虫,属于“落翅型翅二型”,性状明显易观察,是研究落翅型昆虫翅二型分化的理想材料。本文利用转录组测序、基因共表达网络分析以及RNA干扰等方法对家蟋蟀翅二型分化的分子调控机理展开研究,结果如下:1.家蟋蟀翅二型属“落翅型翅二型”,且存在落翅规律。家蟋蟀羽化成虫初期,雌雄虫体的前后翅均发育完全,均表现为有后翅的“长翅型”。羽化成虫后群体内部分个体出现后翅脱落现象。在本文研究中的饲养条件下,家蟋蟀成虫后约20天,群体内落翅个体数达到高峰,而成虫36天后不再落翅,雌雄家蟋蟀的落翅规律基本一致,无明显差异。落翅后的个体,与后翅直接相连接的肌肉组织形态无明显变化。2.家蟋蟀八个生命时期的转录组测序结果。以家蟋蟀落翅高峰期为取样时间依据,选择家蟋蟀1龄若虫(时期I),3龄若虫(时期II),5龄若虫(时期III),羽化成虫初期(时期IV),羽化成虫后第10天(时期V)、20天(时期VI)、30天(时期VII)、40天(时期VIII)共八个时期的家蟋蟀样本,完成转录组测序。共获得135.23Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到5.0Gb,Q30碱基百分比在91.35%及以上;De novo组装后共获得141,456条Unigenes,其中长度在1kb以上的Unigenes有18,771条;对Unigenes进行功能注释,包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对,共获得32,508条Unigenes的注释结果。3.家蟋蟀翅二型分化即落翅高峰期前、中、后三个阶段的差异表达基因分析结果。两两比较家蟋蟀落翅高峰前(时期IV+V)、中(时期VI)、后(时期VII+VIII)三个阶段的差异表达基因(DEGs)。Volcano plot,MA-plot,Heatmap结果显示:在家蟋蟀落翅高峰期时DEGs上调,且表达量越高的基因差异越显著;通过GO,COG,KEGG等数据库对DEGs聚类分析发现,DEGs主要富集在“Amino acid transport and metabolism”、“ribosome,purine metabolism”和“protein processing in endoplasmic reticulum”等通路中,说明这些DEGs主要参与家蟋蟀生长发育过程中的蛋白合成与互作。上述分析结果说明家蟋蟀的落翅型翅二型分化很可能是基因调控的结果。4.利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选调控家蟋蟀翅二型分化即落翅的候选基因。以家蟋蟀8个时期的转录组数据获得的21,922个差异基因为数据集,进行基因的表达模式聚类,获得18个模块(用不同颜色表示,详见4.2.2)。将18个模块与家蟋蟀落翅规律关联分析,筛选出表达模式与家蟋蟀落翅规律正相关系数最高的模块为红色模块。在红色模块内选择表达模式与家蟋蟀落翅规律最为相近的profile 9作为关键profile,并以0.45为阈值筛选出具有功能注释信息的23个基因。利用Cytoscape建立基因共表达网络图,选择MCODE值排名前三的基因作为候选基因,分别为:AdomHSP40(Heat shock protein 40)、AdomCFDP(Craniofacial development protein)、AdomDIS3L(DIS3 Like 3'-5'Exoribonuclease)。此外,profile 9内Nylanderia fulva virus(RNA病毒)在家蟋蟀落翅高峰期的表达量远高于其他基因,推测家蟋蟀可能由于感染该病毒发生落翅现象,因此该基因也被作为候选基因。综上,借助WGCNA的方法,共筛选出四个可能调控家蟋蟀翅二型分化即落翅的候选基因。5.RNAi候选基因后统计落翅率发现:(1)胰岛素受体基因与家蟋蟀翅二型分化即落翅现象无直接调控关系。现有研究表明,胰岛素受体可调控飞虱的翅型分化,本文借助家蟋蟀的转录组数据,筛家蟋蟀中的胰岛素受体(AdomInR:Insulin receptor)作为候选基因之一,经RNA干扰AdomInR后,与野生型组的落翅率相比统计发现,落翅率无显著差异,说明AdomInR不参与调控家蟋蟀的翅二型分化即落翅。本文中家蟋蟀与飞虱翅二型发生的本质存在区别,所以二者翅型分化的分子调控机理可能存在差异。(2)AdomHSP40参与调控家蟋蟀翅二型分化即落翅现象。成功RNA干扰五个候选基因(AdomCFDP、AdomDIS3-L、AdomHSP40、AdomInR和Nylanderia fulva virus),统计注射dsRNA后为期40天内不同处理组家蟋蟀的落翅率,发现仅ds AdomHSP40注射组,与野生型和dsGFP注射组相比,落翅率显著降低;AdomHSP40在家蟋蟀落翅高峰期表达量上调,促进家蟋蟀落翅,而通过RNA干扰AdomHSP40,降低其表达量后,家蟋蟀的落翅率降低,说明AdomHSP40参与调控家蟋蟀翅二型分化即落翅现象。荧光原位杂交(FISH)结果显示AdomHSP40基因在家蟋蟀翅基部有表达,且在落翅高峰期的已落翅家蟋蟀个体中表达量高于落翅高峰期前、后,FISH结果进一步证明了AdomHSP40参与调控家蟋蟀落翅型翅二型分化,并初步对其作用组织进行了定位分析。6.家蟋蟀落翅前后鸣声及生殖器官形态差异比较结果。比较家蟋蟀落翅前后雄虫鸣声发现:落翅前后家蟋蟀鸣声的单脉冲持续时长与单脉冲间隔时间存在显著差异,说明后翅脱落对家蟋蟀前翅的振动发音有显著影响;比较家蟋蟀落翅前后雌雄虫的生殖器官形态,结果显示落翅前后精巢与卵巢形态上均无明显变化,推测落翅对家蟋蟀生殖器官形态无明显影响。综上,本文以“落翅型翅二型”的直翅目昆虫家蟋蟀为研究对象,利用分子生物学和生物信息学等方法研究发现AdomHSP40参与调控家蟋蟀翅二型分化即落翅现象,首次对昆虫落翅的分子机理完成基础研究,可为理解昆虫翅型分化提供科学参考依据。
【学位单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q969
【部分图文】：

家蟋蟀翅二型的分子机理研究

褐飞虱(A)与隐翅虫(B)的翅二型示意图

飞虱,胰岛素,受体

2015年浙江大学张传溪教授团队以褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)为研究对象,发现胰岛素受体(insulin receptor,In R)可调控飞虱的翅型分化[74]。在褐飞虱中存在InR1和InR2两种胰岛素受体,二者通过调控FOXO的活性分别调控飞虱长短翅型的分化(图1.3)。另外,在白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Laodelphax striatellus)中也验证了胰岛素受体对翅型分化的调控作用[74,75]。这是首次发现“天生型翅二型”昆虫翅型分化的分子调控机制,胰岛素在人体内主要参与血糖调节,而在昆虫体内胰岛素受体参与调控翅型分化。2016年,Xinda Lin et al.对c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)通路基因的功能展开研究,发现无论是RNA干扰还是注射JNK基因的抑制剂(inhibitor CC-401)均使四龄雌性飞虱发育为短翅型,这说明JNK基因参与调控飞虱的长短翅型分化,且具有性别特异性[76]。JNK属于丝裂原活化酶mitogen-activated protein kinase(MAPK)家族,MAPK是调控昆虫在紫外照射、热源以及渗透压等刺激下发生应激反应的保守基因[77-79],很可能也参与昆虫的翅型分化,因此,在发现胰岛素受体可调控昆虫翅型分化的功能后,学者对该基因展开了相关研究。2017年,Bi-Yue Ding et al.沉默桔蚜(Aphis citricidus)体内的两种胰岛素受体后,蚜虫出现正常翅、畸形翅、发育不全翅等性状,且分别干扰InR1、InR2或联合干扰二者,会使得群体中的蚜虫分别有73%、60%和87%很难从若虫发育为正常成虫,该结果说明胰岛素受体与桔蚜的生长发育有关,但其是否调控翅型发育还有待进一步研究[80]。2018年,Limei Song et al.对豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)展开研究,分析有翅蚜和无翅蚜的表达差异基因。结果表明peroxisome proliferator-activated receptor(PPRA)可能与豌豆蚜的翅发育相关,嗅觉(olfactory sense)信号通路基因可能参与豌豆蚜的翅二型分化,但具体作用机制尚不清楚[81]。因此,结合现有研究进展,本文对家蟋蟀的胰岛素受体也进行了筛选和功能验证,旨在探究直翅目中落翅型昆虫的翅型分化是否与飞虱等“天生型翅二型”昆虫一致,即受胰岛素受体基因的调控,以调整群体内的翅型比例,进而对种群的动态迁移等产生影响。

蟋蟀,规律,处理组

(1)A处理组:20只/饲养盒(30cm×30cm×5cm),雌虫:雄虫=1:1,10盒为一组,三次重复,共计30盒,600只蟋蟀。雌雄家蟋蟀落翅规律基本一致,在羽化成虫后开始出现后翅脱落现象,约在成虫后20天达到落翅高峰期,成虫后30天开始落翅个体数逐渐回至初成虫时水平,成虫后36天几乎不再落翅。家蟋蟀雌雄群体翅二型分化即落翅规律见图2.1。A处理组中家蟋蟀落翅率的计算方法为:(2)B处理组:100只/饲养盒(53cm×38cm×33cm),雌虫:雄虫=1:1,三次重复,共计300只蟋蟀。本组实验结果中家蟋蟀落翅规律的趋势与A处理组结果相同,群体内落翅高峰期同样在家蟋蟀羽化成虫后20天左右,但是与A处理组相比,在B处理组的结果中,家蟋蟀60天内落翅率显著低于A处理组,说明高密度抑制了家蟋蟀落翅,即有利于维持“长翅型”(有后翅)个体的存在。两种处理下家蟋蟀在羽化成虫后60天内的落翅率比较见图2.2。

【相似文献】