L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造及其在β-丙氨酸生产中的应用

发布时间：2020-10-13 15:29

　　 β-丙氨酸是自然界中唯一的β型氨基酸,其作为重要的中间体,广泛被应用于医药、食品、化工等领域。与目前运用较多的化学法生产β-丙氨酸工艺相比,生物法工艺条件温和,特异性强,环境污染较少,具有重要的工业应用前景以及研究价值。L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,EC4.1.1.11,PanD)能够催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸。但是目前PanD酶活较低,且丙酮酰基依赖型脱羧酶会出现机理性反应失活现象,所以研发高活性和稳定性的新型L-天冬氨酸-α-脱羧酶,是β-丙氨酸工业化生产中的基础。本论文选择昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(TcPanD)基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达。运用蛋白质工程手段对酶基因进行分子改造,以提高其酶活力和催化稳定性。研究结果如下:1、建立包含3500个突变子的TcPanD突变体文库,筛选得到两个催化活力显著提高的突变体16-H5和18-G6,突变位点分别是R98H、K351E、I451V,酶活分别是原始TcPanD酶活的1.61倍和1.43倍。定点饱和突变及分析确定了突变体的最佳氨基酸组合方式,替换的氨基酸分别是R98H和K351S,并将其命名为TcPanD-R38H/K305S。通过对TcPanD进行同源建模,显示突变的氨基酸位置位于表面位置的无规则卷曲处,通过分子对接分析推测远离底物L-天冬氨酸的高酶活突变位点R98可能是通过一定的作用力参与了结构稳定。靠近L-天冬氨酸的突变位点K305可能是通过增强亲水性提高与底物的结合紧密度,从而提高催化活力。2、将TcPanD的原始酶和突变体纯化至电泳纯度,两者纯化蛋白大小均为65kDa。纯化后的突变体比酶活为7.05 U/mg,是原始酶比酶活的2.45倍。对突变体TcPanD-R38H/K305S酶学性质的研究表明:辅酶磷酸吡哆醛的最佳添加量为0.04%(m/v),最适温度为50°C,最适pH为7.0。在低浓度(1mM)的金属离子环境下,Na~+、Ni~(2+)、Co~(2+)、K~+、Ca~(2+)对突变体TcPanD-R38H/K305S有激活作用,高浓度(5mM)的金属离子作用下,激活作用减弱,仅剩下Ni~(2+)、Na~+对突变体TcPanD-R38H/K305S还有明显的激活作用。测定了突变体TcPanD-R38H/K305S的动力学参数,K_m值为1.23 mM,V_(max)值为7.05 U·mg~(-1),酶催化常数K_(cat)为7.64s~(-1),酶催化速率K_(cat)/K_m为6.21 s~(-1)·mM~(-1)。TcPanD的K_m值为1.35 mM,V_(max)值为2.88 U·mg~(-1),K_(cat)为3.12 s~(-1),K_(cat)/K_m为2.31 s~(-1)·mM~(-1)。突变体TcPanD-R38H/K305S表现出更好的底物亲和力以及更高的催化活力。3、以表达突变体TcPanD-R38H/K305S基因的大肠杆菌细胞作为生物催化剂,以L-天冬氨酸为底物,探究了不同催化条件,包括温度、pH、辅酶、金属离子和动力学参数等对β-丙氨酸产量的影响。确定了全细胞催化最适温度为37 ~oC,最适pH为7.0,辅酶磷酸吡哆醛添加量为10μL/mL,底物浓度为50 g/L。在最适催化条件下,β-丙氨酸的产量可达10.89 g/L。最后采用5 L发酵罐诱导培养突变体TcPanD-R38H/K305S,收集的菌体于反应釜中进行全细胞催化反应,反应体系为1L,37 ~oC、pH 7.0以及搅拌速度600 rpm的反应条件下,267 g的底物L-天冬氨酸通过分批补料的方式加入。经过转化,最后得到β-丙氨酸的量为170.53 g,摩尔转化率为95.45%。
【学位单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q55
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 β-丙氨酸的概述
        1.1.1 β-丙氨酸的结构与性质
        1.1.2 β-丙氨酸的应用
        1.1.3 β-丙氨酸的合成
    1.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的概述
        1.2.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化机理
        1.2.2 利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究
    1.3 酶分子改造技术研究概述
        1.3.1 理性设计
        1.3.2 非理性设计
        1.3.3 突变体文库筛选方法
        1.3.4 半理性设计
    1.4 课题的研究目的意义与主要研究内容
        1.4.1 课题研究目的意义
        1.4.2 课题研究内容
第二章 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株和质粒
        2.2.2 试剂和材料
        2.2.3 培养基及相关试剂的配制
        2.2.4 主要器材
    2.3 实验方法
        2.3.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的获得
        2.3.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的引物设计及合成
        2.3.3 易错PCR扩增L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因
        2.3.4 PCR产物纯化回收
        2.3.5 载体的双酶切及纯化
        2.3.6 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因与载体连接
        2.3.7 E.coli BL21(DE3)感受态的准备及转化
        2.3.8 阳性重组质粒的鉴定
        2.3.9 随机突变文库的筛选
        2.3.10 突变体L-天冬氨酸-α-脱羧酶的酶活测定方法
        2.3.11 突变体的定点饱和突变
        2.3.12 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的同源建模及突变位点分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 TcPanD基因的随机突变
        2.4.2 变体文库的初筛
        2.4.3 突变文库复筛
        2.4.4 定点饱和突变
        2.4.5 突变体的分子对接分析
    2.5 小结
第三章 L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质研究
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 试剂与材料
        3.2.3 培养基与缓冲液
        3.2.4 仪器与设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 突变体的表达与纯化
        3.3.2 蛋白含量测定
        3.3.3 SDS-PAGE电泳
        3.3.4 突变体的酶活测定
        3.3.5 辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量对酶的影响
        3.3.6 酶的最适温度及温度稳定性测定
        3.3.7 酶的最适pH及 pH稳定性测定
        3.3.8 不同浓度金属离子对酶活的影响
        3.3.9 酶的反应动力学参数测定
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 蛋白质浓度标准曲线
        3.4.2 SDS-PAGE分析
        3.4.3 酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量对突变体的影响
        3.4.4 酶的最适温度及温度稳定性
        3.4.5 酶的最适pH及 pH稳定性
        3.4.6 不同浓度金属离子对酶活力的影响
        3.4.7 突变体的动力学参数
    3.5 小结
第四章 L-天冬氨酸-α-脱羧酶重组菌的5 L发酵罐培养及全细胞转化
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 培养基与缓冲溶液
        4.2.3 主要仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 全细胞生物催化剂的制备
        4.3.2 转化时间对β-丙氨酸产量的影响
        4.3.3 转化温度对β-丙氨酸产量的影响
        4.3.4 缓冲液pH对 β-丙氨酸产量的影响
        4.3.5 辅酶PLP添加量对β-丙氨酸产量的影响
        4.3.6 底物浓度对β-丙氨酸产量的影响
        4.3.7 全细胞转化制备β-丙氨酸
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 转化时间对产β-丙氨酸的影响
        4.4.2 转化温度对产β-丙氨酸的影响
        4.4.3 缓冲液pH对产β-丙氨酸的影响
        4.4.4 辅酶PLP添加量对产β-丙氨酸的影响
        4.4.5 底物浓度对产β-丙氨酸的影响
        4.4.6 全细胞转化制备β-丙氨酸
    4.5 小结
第五章 总结和展望
    5.1 总结
    5.2 展望
参考文献
致谢
作者简介
    1 作者简历
    2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
学位论文数据集

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本文编号：2839352