红平红球菌rpf基因突变、生物活性及应用研究

发布时间：2020-10-13 22:28

　　 自然环境拥有丰富的微生物资源,目前实验室条件下能够培养的微生物只占总量的0.01%-1%。复苏促进因子Rpf(Resuscitation promoting factor,Rpf)是首次被发现能够促使休眠细菌复苏和生长的细胞因子。石油污染长期危害自然环境和人类健康,微生物修复已成为石油污染土壤修复的主要技术之一,然而自然环境中许多有石油降解活性的微生物处于难培养状态。本文通过突变技术研究红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)复苏促进因子Rpf的生物学性质及对休眠细胞的复苏促进作用,探究Rpf作用机理,并将纯化的重组Rpf蛋白用于自然环境中高效石油污染降解菌的分离筛选。将红平红球菌KB1的rpf基因重组质粒BL21-pET-32a-rpf在大肠杆菌中高效表达,利用Ni琼脂糖亲和层析纯化重组Rpf蛋白,SDS-PAGE电泳分析其表达蛋白的分子量为37 kDa,重组Rpf蛋白的溶菌酶活力为1760 U/mg,蛋白酶活力为1634 U/mg。0.1 mM的Zn~(2+)能增加溶菌酶活性,Ca~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、DTT、EDTA、PMSF等对其溶菌酶活性影响不明显。纯化的重组Rpf蛋白对红平红球菌KB1的生长有明显促进作用,且能促进VBNC状态KB1细胞的复苏,复苏效果随重组Rpf蛋白浓度的增加而更加显著。利用定点突变技术对rpf基因序列溶菌酶活性相关部分氨基酸Asp~(45),Cys~(50),Glu~(51),Thr~(60),Gln~(69),Thr~(74),Trp~(75)和Cys~(114)进行了定点突变,构建了几种不同Rpf氨基酸突变体质粒,在大肠杆菌中诱导表达及Ni琼脂糖亲和层析纯化,发现突变后的Rpf溶菌酶活性发生了不同程度改变,其中C50G+C114T突变体溶菌酶活性丧失了86.68%,D45A+E51K突变体溶菌酶活性丧失了84.43%,Q69K突变体溶菌酶活性丧失86.11%,E51A突变体活性丧失11.14%,而W75V突变体的溶菌酶活性增加了94.45%。Rpf促生长和复苏作用与溶菌酶活性密切相关,C50G+C114T突变体的促生长作用和复苏作用消失,W75V突变体能显著增加红平红球菌细胞生长及非可培养细胞的复苏。将红平红球菌重组Rpf蛋白添加到石油污染土壤样品中,研究了其对土壤中石油降解菌的分离效果,发现添加Rpf能促进土壤中石油降解微生物的分离效果。从添加Rpf的土壤样品新分离出9株石油降解细菌,通过16S rDNA序列分析确定其分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、赖氏菌属(Leifsonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微杆菌属(Microbacterium)。用红外测油仪测定所分离菌株对石油的降解作用,发现芽孢杆菌(Bacillus sp.)JC1、(Bacillus sp.)JD5、(Bacillus sp.)FD1、(Bacillus sp.)JP3和(Bacillus sp.)FP3的降解率为43.94%、41.58%、28.96%、44.38%和29.87%,苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)JP1和(Ochrobactrum sp.)FP1的降解率分别为36.12%和34.27%,微杆菌(Microbacterium sp.)JD2和(Microbacterium sp.)FD2的降解率为26.01%和20.46%。
【学位单位】：兰州理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X172;X53
【部分图文】：

红平红球菌 rpf 基因突变、生物活性及应用研究表 2.2 蛋白标准曲线制作方法Table 2.2 The method of making the standard protein curve号 0 1 2 3 4 溶液（mL） 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 （mL） 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 试剂（mL） 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 度 A5950.000 0.034 0.069 0.100 0.137 表 2.2 中所得数值绘制蛋白的标准曲线如图 2.1，蛋白浓度计算x-0.0004。

表 2.3 4-methylumbellifery 标准曲线Table 2.3 The standard curve of 4-methylumbellifery样品 1 2 3 4 5 度（nmol/L） 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 （μL） 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00体积（μL） 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 液（mL） 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 光强度 0.096 0.176 0.248 0.322 0.379表 2.3 所测荧光强度绘制标准曲线如图 2.2 所示，酶活计算式+0.106。

图 2.3 纯化 Rpf 蛋白的 SDS-PAGE 分析的 Rpf 蛋白；2：破碎上清液；3：破碎菌体沉淀；M：蛋白Fig. 2.3 SDS-PAGE analysis of puried Rpf proteinrotein；2：Broken supernatant；3：Broken cell pellet；4：pf 蛋白的 Western-Blotting 鉴定f 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳后按照 2.1.5 步骤选择一 与二抗 Goat Anti-rabbit IgG/HRP 进行 Western-blo阳性染色带，如图 2.4 所示。图 2.4 Western-blotting 鉴定纯化 Rpf 蛋白
【参考文献】

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本文编号：2839776