拟南芥糖基转移酶基因UGT73C4参与抗病的作用分析

发布时间：2020-10-14 00:38

　　 自然界中的病源微生物无处不在,它们通过不同的途径进入植物体内,寄宿在植物体细胞间,导致植物产生病害。糖基转移酶是一类负责糖基化修饰的酶,它能将糖基从供体转移到受体分子上,从而改变受体分子的稳定性、水溶性等,进而对植物生长发育和适应环境中起着重要作用。根据公开获得的芯片数据和发表的文献得知,拟南芥糖基转移酶基因UGT73C4受病原菌和水杨酸(SA)诱导上调表达,这暗示着UGT73C4基因可能参与拟南芥的生物胁迫。为了明确糖基转移酶UGT73C4的生物学功能,开展了本课题研究。首先用病原细菌Pst DC3000处理两周龄的野生型拟南芥,并用实时荧光定量PCR技术检测了UGT73C 基因在病原细菌处理不同时间后的表达水平。结果显示,UGT73C4受病原菌诱导上调表达,且在24h上调最为明显。同时,又用病原细菌Pst DC3000处理由UGT73C4启动子驱动GUS基因表达的转基因株系,发现在病原细菌处理后,转基因植物叶片组织的GUS染色显著加深。另外,还检测到UGT73C4基因受SA诱导表达。这些结果说明糖基转移酶基因UGT73C4受病原细菌Pst DC3000和SA诱导表达,可能参与植物的抗病反应。在获得了UGT73C4基因的过表达株系和敲除株系材料后,我们用Pst DC3000分别注射UGT73C4的敲除株系、过表达株系和野生型株系,发现UGT73C4过表达株系的病菌数量显著少于野生型和突变体株系,证明糖基化转移酶UGT73C4参与植物抗病反应,同时利用烟草瞬时转化实验也进一步证明了糖基转移酶UGT73C4参与植物免疫反应。在此基础上,进一步探索了UGT73C4基因在植物应对生物胁迫中的作用机制。通过DAB和NBT等组织化学染色实验发现UGT73C4过表达株系有明显的活性氧积累,通过qPCR检测发现与SA信号途径有关的PRl、PR2等抗病响应基因在过表达株系中明显上调,推测UGT73C4可能是通过SA途径参与植物抗病的。进一步检测了SA合成相关基因或者SA合成调节基因,发现在病原细菌处理后,UGT73C4过表达株系中EDS1、PAD4、ICS7等基因表达水平均显著高于突变株系和野生型拟南芥。通过高效液相色谱结合质谱技术分析检测了病原细菌处理后24h的不同基因型株系中SA的含量,发现不论是自由态的SA还是总SA含量,在过表达株系中均明显高于野生型和突变体植株。证明糖基转移酶UGT73C4是通过SA的积累,进而增强植物的抗病性。本研究还发现糖基转移酶基因UGT73C4受土壤病原真菌Foc699诱导表达上调。我们用带GFP标签的Foc699菌株处理UGT73C4的敲除株系、过表达株系和野生拟南芥,通过荧光显微镜发现过表达株系根上的真菌Foc699荧光含量明显少于突变体和野生型。在病原真菌Foc699侵染各基因型株系的根部并转入土壤继续培养,发现过表达株系长势明显好于突变体和野生型株系,说明糖基转移酶UGT73C4能够提高植物地下部分对土传病原菌的抗性。同时,发现过表达株系在根中与茉莉酸(JA)和抗真菌相关的标志基因上调表达,反映出UGT73C4导致的植物根系抗病可能涉及到JA信号途径。本研究还构建了UGT73C4基因的原核表达载体,纯化了在细菌中表达的糖基转移酶UGT73C4,对植物的某些天然代谢物进行了酶活性分析,但目前尚未确定该糖基转移酶的作用底物。总之,本论文通过对UGT73C4基因的突变体和过表达体的一系类研究,明确了糖基转移酶UGT73C4在植物地上部和地下部抗病响应中发挥着重要作用,初步说明UGT73C4导致的抗病响应可能与SA以及JA信号途径有关。但是更深层的抗病机理还需要进一步研究。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S432.23
【部分图文】：

图３－１－１?Ｃ／Ｇ７７３ＣＷ基因表达受病原细菌和ＳＡ的类似物ＩＮＡ诱导??Ａ：?ＤＣ３０００?处理?Ｂ：?ＩＮＡ?处理??１．２?ｔ／Ｇ７７ＪＣ／启动子：ＧＵＳ转基因植株的获得和基因表达模式分析??１．２．１?启动子克隆??为了研宄基因在拟南芥植株的具体表达部位以及进一步验证受病??原菌和ＳＡ的诱导表达情况，我们克隆了?的启动子。根据ＴＡＩＲ网站??（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）提供的序列信息，确定ｔ／ＧＴ７３Ｃ＾基因起始密码前??１５００ｂｐ的ＤＮＡ序列作为该基因的启动子区域。设计启动子特异引物，然后利用??高保真Ｔａｑ酶和ＰＣＲ技术从拟南芥基因组ＤＮＡ扩增出该启动子序列，如图３－１－２。??将扩增的启动子序列连接到ｐＥａｓｙ－Ｂｌｕｎｔ?Ｓｉｍｐｌｅ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?Ｋｉｔ提供的载体上，经过??蓝白斑筛选，筛选出白色阳性菌落。挑取单菌落，经ＰＣＲ和测序验证启动子序??列是正确的。??

图３－１－２?｛／Ｇ７７３ＣＷ启动子的扩增??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?１：?ｔ／Ｇ７７３ＣＶ?启动子序列??动子：ＧＵＳ载体构建与转基因株系的筛选??隆载体上提取质粒，然后用及？Ｈ?Ｉ和／／／ｍｉｎｉ进行酶切，段进行回收后连接到ＰＢＩ１２１载体上，替换载体上的３５Ｓ转化、筛选、单菌落ＰＣＲ分析和测序验证，然后转化感染拟南芥。获得转基因株系后用ＰＣＲ验证转基因成功的引物扩增，转基因株系能扩出启动子的条带，而非转基因启动子载体构建与转基因株系的筛选如图３－１－３。??

图３－１－３载体构建与筛选??Ａ：?启动子：ＧＵＳ载体转化细菌的蓝白斑筛选??Ｂ：?ｉ／Ｇ７７ｊＧ＾启动子：ＧＵＳ载体的酶切验证（５卿１１１＋／／加＜１１１１）??Ｃ：转基因绿苗筛选?Ｄ：转基因植株的ＰＣＲ验证??．２．３?在不同组织的表达分析??获得ｆ／Ｇ７７３ＣＶ启动子：ＧＵＳ转基因拟南芥植株后，我们对其不同发育时期??不同组织部位进行ＧＵＳ染色，发现ｔ／Ｇ７７３ＣＷ基因主要在１周大小幼苗期子??、根尖、真叶处表达，而在生长２周后的楦株叶片和根中表达都很弱，开花抽??以后只在花、果中有较弱的表达。如图３－１－４。??
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本文编号：2839921