小鼠克隆胚胎重编程的DNA甲基化模式分析与表观标记挖掘
发布时间：2020-10-17 00:56
体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)又称为克隆,是目前动物细胞工程领域一种研究细胞重编程常用的技术手段,可以将终末分化的细胞重新编程为具有全能性状态的细胞,并发育为同质个体后代。尽管核移植技术在重编程研究中具有安全和可获得全能性细胞的优点,但是在多数动物中重编程的效率仍然非常低,大部分克隆胚胎在早期发育期间会发生发育阻滞。研究表明克服表观遗传障碍是目前提高重编程效率的重要策略,其中关键组蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3已经被明确标记为重编程表观屏障,而关于DNA甲基化分子标记物的报导却很少,急需通过组学方法进行挖掘分析。本文的研究中,我们分析了不同发育命运克隆胚胎与正常受精胚胎的DNA甲基化谱,发现克隆胚胎与正常受精胚胎相比在全局去甲基化的过程中表现出甲基化较高的特点,我们进一步对差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions,DMRs)进行分析并识别出克隆胚胎中三种异常的甲基化模式,包括重新甲基化的DMRs(rDMRs)、持续甲基化的DMRs(pDMRs)和去甲基化的DMRs(dDMRs)。另外,我们发现启动子区域、第一内含子和3'UTR是DMRs重点分布的基因组功能区域,并且DMRs的长度与DNA甲基化水平的差异明显的负相关,DMRs长度越短,DNA甲基化水平变化越大。克隆胚胎较高的甲基化水平导致早期合子基因组基因、多能性维持因子以及关键转录因子未正确激活,这是克隆胚胎重编程失败的重要原因。之后,我们联合转录RNA-seq数据进行综合分析,鉴定出SCNT中高DNA甲基化与基因表达下调的基因簇,这些基因的低表达会引起克隆胚胎发育脱离正常轨道。进一步我们通过构建加权基因共表达网络识别出一系列关键重编程表观障碍因子,包括Sp110、Sp140、Pcgf5、Zfp207、Ubtfl1、Serbp1、Dppa2、Yy1、Prps1、Rrn3、Obox6、Kpna2、Elovl6、Trim13、Katna1等。其中Dppa2、Obox6、Pcgf5、Yy1、Rrn3等已被证实是体细胞重编程中关键基因,对促进细胞重编程的进程有重要作用。最后,我们对细胞重编程中甲基转移酶(Dnmt家族)和去甲基化酶(Tet家族)进行了系统的比较分析,研究发现Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在克隆胚胎中基因表达水平升高,而Tet家族中,只有Tet1基因表达水平下降,这表明克隆胚胎的高甲基化可能是由Dnmt家族的高表达和Tet1的低表达共同造成的。本研究全面地分析了克隆胚胎全基因组DNA甲基化的异常模式,为克服重编程中DNA甲基化表观遗传屏障,提高重编程效率提供了一定的理论支持,对于后期体细胞核移植的临床应用具有一定的帮助。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q813
【部分图文】：
细胞编程与重编程.1 细胞编程细胞编程的过程实际上是细胞不断分化并丧失全能性的过程。在哺乳动物中，细胞的编于受精卵细胞。由于受精的过程，卵母细胞染色体数目加倍，重新激活了处于静止期（M2细胞。经过多次快速的有丝分裂形成了大量的卵裂球，而由于卵裂速度快，并处于保护质壳（透明带）中，来不及伴随细胞体积和物质增加，因此核质指数不断升高，卵裂速慢或停滞，直到从透明带中孵出才能继续发育。随着卵裂球的致密化，形成实心细胞团为桑椹胚（morula），以模型动物小鼠为例，大约发育到 3.5 天左右，桑椹胚形成空心结分化为两个细胞群体：内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）和滋养层（Trophectoderm, TE）为囊胚。其中滋养层是胚胎胎盘成分的前体，而包裹充满液体的内细胞团，包含原始内，和更深层的多能外胚层细胞，它们是胎儿发育的祖细胞来源（图 1-1）。
图 1-2 不同重编程技术示意图[8]Fig 1-2 Schematic diagram of different reprogramming techniques[8]传学的研究技术与方法学是对可遗传表型变化的研究，这种变化是由改变基础 DNA 序是在染色质修饰的背景下进行。表观遗传修饰作用在染色质的高控，进而影响基因的转录表达。表观遗传学这一名词最初是由 W基因的物理性质及其在遗传中的作用尚不清楚，因此很难解释表观遗传学是经典遗传学的另一方面，提供基因时空特异性表达的指白共价修饰、染色质可及性的调节，可以实现基因选择性转录；要是由基因组中的非编码 RNA 实现的。这些所有的表观遗传修饰
图 2-1 数据分析流程Fig. 2-1 Data analysis process.2 数据的下游分析.2.1 差异甲基化位点与差异表达基因分析首先进行差异 DNA 甲基化分析，剔除覆盖度小于 3 的 CpG 位点，剩余位点作为有pG 位点用于之后的分析。定义| β|>0.2，wilcoxon 秩和检验 p-value <0.05 的 CpG 位点 DNA 甲基化位点，其中 p-value 越小认为差异显著性越高。对于差异基因分析，首先剔除了样品中所有重复样本 FPKM< 0.1 的基因，剩余的基是表达的基因。差异表达分析使用 R 包 DEseq2 进行，定义差异倍数大于 2 倍差异og2FC > 1 为上调，log2FC < -1 为下调，并且 q-value< 0.05 为差异表达基因。q-value -value 矫正的结果。
【相似文献】
本文编号：2844032
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q813
【部分图文】：
细胞编程与重编程.1 细胞编程细胞编程的过程实际上是细胞不断分化并丧失全能性的过程。在哺乳动物中，细胞的编于受精卵细胞。由于受精的过程，卵母细胞染色体数目加倍，重新激活了处于静止期（M2细胞。经过多次快速的有丝分裂形成了大量的卵裂球，而由于卵裂速度快，并处于保护质壳（透明带）中，来不及伴随细胞体积和物质增加，因此核质指数不断升高，卵裂速慢或停滞，直到从透明带中孵出才能继续发育。随着卵裂球的致密化，形成实心细胞团为桑椹胚（morula），以模型动物小鼠为例，大约发育到 3.5 天左右，桑椹胚形成空心结分化为两个细胞群体：内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）和滋养层（Trophectoderm, TE）为囊胚。其中滋养层是胚胎胎盘成分的前体，而包裹充满液体的内细胞团，包含原始内，和更深层的多能外胚层细胞，它们是胎儿发育的祖细胞来源（图 1-1）。
图 1-2 不同重编程技术示意图[8]Fig 1-2 Schematic diagram of different reprogramming techniques[8]传学的研究技术与方法学是对可遗传表型变化的研究，这种变化是由改变基础 DNA 序是在染色质修饰的背景下进行。表观遗传修饰作用在染色质的高控，进而影响基因的转录表达。表观遗传学这一名词最初是由 W基因的物理性质及其在遗传中的作用尚不清楚，因此很难解释表观遗传学是经典遗传学的另一方面，提供基因时空特异性表达的指白共价修饰、染色质可及性的调节，可以实现基因选择性转录；要是由基因组中的非编码 RNA 实现的。这些所有的表观遗传修饰
图 2-1 数据分析流程Fig. 2-1 Data analysis process.2 数据的下游分析.2.1 差异甲基化位点与差异表达基因分析首先进行差异 DNA 甲基化分析，剔除覆盖度小于 3 的 CpG 位点，剩余位点作为有pG 位点用于之后的分析。定义| β|>0.2，wilcoxon 秩和检验 p-value <0.05 的 CpG 位点 DNA 甲基化位点，其中 p-value 越小认为差异显著性越高。对于差异基因分析，首先剔除了样品中所有重复样本 FPKM< 0.1 的基因，剩余的基是表达的基因。差异表达分析使用 R 包 DEseq2 进行，定义差异倍数大于 2 倍差异og2FC > 1 为上调，log2FC < -1 为下调，并且 q-value< 0.05 为差异表达基因。q-value -value 矫正的结果。
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相关硕士学位论文 前2条
1 曹鹏波;小鼠克隆胚胎重编程的DNA甲基化模式分析与表观标记挖掘[D];内蒙古大学;2019年
2 杨胜楠;泛癌症DNA甲基化模式分析[D];西安电子科技大学;2017年
本文编号：2844032
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