草鱼细胞中活化的STAT3能通过对Bcl-2进行调控进而缓解自噬

发布时间：2020-10-24 23:51

　　 在哺乳动物中,信号转导与转录激活因子3(Signal transducer and activator transcription 3,STAT3)能被细胞因子激活,是一个关键的转录因子,能够转录调控下游基因。近年来的研究表明,STAT3不仅存于核内,而且核外也有STAT3。于核内,STAT3被激活,靶向下游基因,能够调节细胞自噬,于核外,STAT3与PKR相作用,通过调节eIF2α调节自噬。哺乳动物中,IL-6/JAK/STAT3信号通路参与免疫应答、细胞增殖、细胞存活以及新陈代谢。在本文中,我们分别使用自噬诱导剂Rapamycin和Tunicamycin对细胞进行刺激,荧光定量检测草鱼白介素6受体(CiIL-6r)的表达,结果显示其表达降低,但当使用人源重组白介素6(rIL-6)短时间处理后,CiIL-6r的表达增加,并且超过空白对照组。我们认为rIL-6可能抑制了自噬。Western blot实验检测自噬指示蛋白LC3,自噬诱导剂处理(Rapamycin和Tunicamycin)的细胞实验组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值分别为0.84和4.7,相对于对照组,自噬增强,IL-6短时间作用后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低至0.45和0.69,即自噬情况减轻。除此之外,我们通过将重组质粒GFP-CiLC3转染至草鱼CIK细胞,经过共聚焦显微镜检测荧光,证实,自噬诱导剂Tunicamycin(Rapamycin)能诱导细胞产生自噬,但经过IL-6短时间作用后,自噬情况减轻。我们认为rIL-6抑制了自噬。为验证STAT3是否参与rIL-6抑制了自噬过程,我们分别使用自噬诱导剂Rapamycin和Tunicamycin对细胞进行梯度时间刺激,荧光定量检测CiSTAT3的表达,结果显示STAT3一直处于被抑制的状态,并且在24h达到最低,当细胞处于自噬诱导剂Tunicamycin作用下,使用rIL-6作用能使得CiSTAT3表达增加。我们认为STAT3参与自噬过程。接下来我们将重组质粒FLAG-tagged CiSTAT3与GFP-tagged CiSTAT3共转入HEK-293T细胞中,免疫共沉淀实验(CO-IP)表明无IL-6作用下,CiSTAT3不会自身形成二聚体,而IL-6作用下,CiSTAT3形成二聚体,说明鱼类STAT3被IL-6所激活。在哺乳动物中,Bcl-2是STAT3的下游靶基因,并且,其不仅参与调节细胞凋亡,而且还参与细胞自噬调节。荧光定量结果也显示,自噬诱导剂Tunicamycin作用下BCL-2表达降低,在IL-6作用下,Bcl-2表达量升高,与IL-6R、STAT3情况相一致。为验证CiSTAT3是否能激活CiBcl-2基因的表达,我们将分别将pCDNA3.1-ORF-CiSTAT3与pGL3-CiBcl-2、pCDNA3.1-Basic与pGL3-CiBcl-2共转到CIK细胞,检测Bcl-2启动子的转录活性。双荧光素酶活性分析结果显示,CiSTAT3能上调CiBcl-2的转录活性,使之大量表达。Bcl-2作为抗凋亡基因,其与BAX这个基因表达的比值能反应细胞凋亡情况。我们使用One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit检测细胞凋亡的情况,结果显示,自噬诱导剂TM会引发细胞凋亡,但在加入IL-6短时间孵育后,细胞凋亡减轻。除此之外,我们还使用CCK8对细胞活性进行了检测,检测结果表面,自噬诱导剂TM使得细胞活性降低,但在IL-6短时间作用后,细胞活性有所回升。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q25
【部分图文】：

图 3.1B 草鱼 LC3 蛋白在 CIK 细胞中的表达Fig 3.1B Expression of CiLC3 protein levels in CIK ce 检测 CiLC3 和 CiGAPDH。设 CiGAPDH 灰度值为相对于 CiGAPDH 的灰度值。

CGFP-LC3的免疫荧光检测

草鱼 BCL-2 蛋白与斑马鱼、鲤鱼亲缘关系较近(图3.4)。通过 NCBI 进行 BLAST 核苷酸序列分序，其与斑马鱼相似度达到 90%。图 3.4 草鱼 BCL-2 的系统进化树Fig 3.4 Phylogenetic tree of CiBCL-2MEGA 7 软件比对 19 个物种 BCL-2 的蛋白序列，从上到下依次是斑马鱼、草鱼(已标记)、鲤鱼、白鲑、鲈鱼、犬、褐家鼠、智人、山羊、家猫、东方鲀、银汉鱼、河蚬、水螅、果蝇、白虾、蟹、菜蛾、牛疱疹病毒 4。3.5 草鱼 STAT3 转录调控草鱼 BCL-23.5.1 草鱼 STAT3 能上调草鱼 BCL-2 启动子活性将构建的重组质粒 pCDNA3.1-STAT3(或 pCDNA3.1-Basic)、pGL3-BCL-2 以及带有荧光素酶基因的质粒共转染至 CIK 细胞，检测双荧光素酶活性(图 3.5A)。结果表明，过表达草鱼 STAT3 能使得 BCL-2 启动子活性显著提升。
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本文编号：2855142