产普鲁兰酶菌株的筛
发布时间：2020-11-01 11:58
普鲁兰酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是一种淀粉脱支酶,能够专一性地作用于普鲁兰糖、支链淀粉、极限糊精中的α-l,6糖苷键,切下整个侧枝,形成直链淀粉,是淀粉加工业中的关键酶,在食品、酿造、医疗、化工等行业中也有着极大的应用需求。本研究以淀粉厂污水为原料,旨在筛选出产普鲁兰酶优势菌株,对其进行菌种鉴定,克隆出其普鲁兰酶基因并通过异源表达提高其发酵水平,研究纯化后的重组酶的酶学性质,对国内普鲁兰酶的开发和应用具有重要意义。主要研究内容如下:(1)通过以支链淀粉为唯一碳源进行初筛,普鲁兰糖培养基进一步鉴定,结合酶活力测定,从淀粉厂污水中分离筛选出一株产普鲁兰酶活力较高的菌株LK18(1.53±0.16 U/mL)。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA序列同源性分析及系统进化树构建等方法,将其鉴定为Paenibacillus puldeungensis,并命名为Paenibacillus puldeungensis LK18。(2)选取与Paenibacillus puldeungensis LK18的16S rDNA同源性较高的菌株的普鲁兰酶蛋白序列进行多序列比对,通过CODEHOP法设计兼并引物,扩增出部分普鲁兰酶编码序列。然后根据该段基因序列的比对结果,进一步设计引物扩增出全长序列pulA,该基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过生物信息学分析,该酶为I型普鲁兰酶,属于糖苷水解酶13家族。(3)构建重组表达载体pET-28a(+)-pulA,在E.coli BL21(DE3)中进行异源表达并初步探索其诱导条件,结果显示:在22℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导12 h,该重组酶的表达效果最好,酶活力可达248.52 U/mL。(4)通过镍柱亲和层析对最优诱导条件下的粗酶液进行纯化,成功分离出重组蛋白,其分子量约为76.95 kDa,测定出重组酶的比酶活达508.8 U/mg。酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH为6.0,在35℃~40℃或pH 6.0~8.0条件下较为稳定。10 mmol/L的K~+和Mg~(2+)对该重组酶有激活作用,Zn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)等对其有不同程度的抑制作用,其他离子对该酶无明显作用。以普鲁兰糖为底物时,该酶的Km值和Vmax值分别为3.69 mg/mL和384.62μmol/(min·mL)。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
图 1-1 普鲁兰糖的水解方式Fig.1-1 Enzymatic degradation of pullulan 普鲁兰酶的产生菌种 1961 年 Bender 和 Wallenfels 首次从产气气杆菌 Aerobacter aerogene 中酶以来，研究人员从多种细菌、真菌和古生菌中发现了普鲁兰酶的存在[1
us GK-24 75 5.5 65 构与催化机理构特征糖基水解酶 GH13 家族（又称 α-淀粉酶家族），类都含有 4 个保守的结构域（I~IV），共同组鲁兰酶也含有 4 个这样的结构域（表 1-3）， α 螺旋结构的形成，它们组成了(β/α)8桶状结构叠桶第三个 β 折叠和第三个 α 螺旋之间的一个和活性口袋；结构域 III 位于结构域 I 的 C 端，结构；结构域 IV 位于结构域 I 的 N 端，是由反向平行 β 片层的 β 三明治型结构[29]。
图 2-1 葡萄糖标准曲线Fig.2-1 The standard curve of glucose图 2-1 所示，以葡萄糖为标准品，采用 DNS 绘制标准曲线，曲线方程11x-0.0227，相关系数 R2=0.9984，表明在测定范围内，葡萄糖浓度和 OD的线性关系。菌种筛选过以支链淀粉为唯一碳源的培养基进行初筛，共挑选出 32 株碘液染色后能水解圈（图 2-2a）的菌株，将其转接到普鲁兰糖鉴别培养基进一步鉴定， 6 株在普鲁兰糖鉴别培养基上呈现出较大透明圈（图 2-2b）的菌株。将这种到发酵培养基进一步发酵培养，通过 DNS 法测定其发酵上清液酶活力其中菌株 LK18 的酶活力最高，为 1.53±0.16 U/mL，将其作为后期研究的对
【参考文献】
本文编号：2865498
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
图 1-1 普鲁兰糖的水解方式Fig.1-1 Enzymatic degradation of pullulan 普鲁兰酶的产生菌种 1961 年 Bender 和 Wallenfels 首次从产气气杆菌 Aerobacter aerogene 中酶以来，研究人员从多种细菌、真菌和古生菌中发现了普鲁兰酶的存在[1
us GK-24 75 5.5 65 构与催化机理构特征糖基水解酶 GH13 家族（又称 α-淀粉酶家族），类都含有 4 个保守的结构域（I~IV），共同组鲁兰酶也含有 4 个这样的结构域（表 1-3）， α 螺旋结构的形成，它们组成了(β/α)8桶状结构叠桶第三个 β 折叠和第三个 α 螺旋之间的一个和活性口袋；结构域 III 位于结构域 I 的 C 端，结构；结构域 IV 位于结构域 I 的 N 端，是由反向平行 β 片层的 β 三明治型结构[29]。
图 2-1 葡萄糖标准曲线Fig.2-1 The standard curve of glucose图 2-1 所示，以葡萄糖为标准品，采用 DNS 绘制标准曲线，曲线方程11x-0.0227，相关系数 R2=0.9984，表明在测定范围内，葡萄糖浓度和 OD的线性关系。菌种筛选过以支链淀粉为唯一碳源的培养基进行初筛，共挑选出 32 株碘液染色后能水解圈（图 2-2a）的菌株，将其转接到普鲁兰糖鉴别培养基进一步鉴定， 6 株在普鲁兰糖鉴别培养基上呈现出较大透明圈（图 2-2b）的菌株。将这种到发酵培养基进一步发酵培养，通过 DNS 法测定其发酵上清液酶活力其中菌株 LK18 的酶活力最高，为 1.53±0.16 U/mL，将其作为后期研究的对
【参考文献】
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本文编号：2865498
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