Gspt1l在斑马鱼肝脏发育中的功能研究

发布时间：2020-11-01 15:12

　　 肝脏是脊椎动物特有的器官,在糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢、毒物代谢中发挥着重要作用。肝脏的发育在时空上受到严格的调控,近年来肝脏发育的研究使人们对于肝细胞命运决定和肝细胞分化的分子机制有了更深入的了解,为肝病的治疗提供了重要的理论依据。斑马鱼具有体外发育、胚胎透明、胚胎量大以及发育时间短的优势,已经成为研究胚胎早期发育的理想模式动物,而且调控肝脏发育的分子机制在人类和斑马鱼之间是保守的。斑马鱼肝脏的发育可以大致分为特化(Specification)、出芽(Budding)、生长(Outgrowth)等时期,虽然很多研究揭示了调控肝脏特化以及出芽的分子机制,但肝脏生长和分化过程中分子机制的研究是不完善的。斑马鱼gspt1l(G1 to S Phase Transition 1,like)是人类GSPT1/eRF3α(真核肽链释放因子GTP结合亚基3α,Eukaryotic Peptide Chain Release Factor GTP-binding subunit 3α)的同源基因,属于小GTPase家族。GSPT1通过结合GTP激活真核翻译终止因子1(Eukaryotic Translation Termination Factor 1,eRF1)促进肽链翻译的终止。有研究表明GSPT1还通过参与14-3-3蛋白和凋亡信号调节激酶1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1,ASK1)复合体的解聚诱发细胞凋亡。GSPT1缺失导致细胞周期G1期(Gap 1 phase)停滞,细胞质中未结合mRNA的核糖体亚基增多。在斑马鱼中gspt1l突变会导致胚胎致死,并在发育过程中出现血管增生。正向遗传学筛选是一种发现新颖基因的重要手段,在之前的研究中我们利用ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)随机诱变后筛选得到了一系列的肝脏发育缺陷型家系。其中v28突变体中肝脏以及外分泌胰腺、肠道祖细胞特化和出芽正常但生长被抑制,而且v28突变体中肝脏分化基因lfabp、gc的表达延迟,表明肝细胞分化被抑制。通过图位克隆我们发现在v28突变体中gspt1l基因发生了无义突变。并且注射gspt1l野生型的mRNA可以部分挽救v28突变体的肝脏表型,说明gspt1l是v28的突变基因。gspt1l在肝脏、外分泌胰腺、肠道中有表达,这也和v28突变体中消化器官缺陷的表型是相吻合的。为了研究gspt1l在消化器官发育中的作用首先我们通过细胞增殖和凋亡实验证明了gspt11~(v28)突变通过降低细胞增殖速度影响了肝脏的生长。有文献报道斑马鱼gspt1l突变可以激活内质网未折叠蛋白应答(Unfolded Protein Response,UPR)进而使脑血管发育畸形。UPR主要通过ATF6(Activating Transcription Factor 6)、PERK(Double-Stranded RNA-activated Protein Kinase(PKR)–like ER Kinase)、IRE1(Inositol Requiring Enzyme 1)三条通路调控内质网压力(ER stress)条件下细胞的应激反应,在ER stress前期阶段UPR主要促进细胞生存,当ER stress持续损害细胞时UPR转而促进细胞凋亡。在体外研究中人们发现具有促进细胞生存的ATF6、IRE1通路活性在ER stress第二阶段会逐渐衰减,而我们发现在gspt11~(v28)突变体中IRE1通路活性不会发生衰减。而且ER stress的抑制剂TUDCA(Sodium Tauroursodeoxycholate)可以降低gspt11~(v28)突变体中IRE1通路的活性并部分挽救肝细胞分化延迟的表型,但对肝脏及其他消化器官的增殖缺陷没有作用。为了进一步证明是否IRE1通路的活性是影响肝细胞分化的原因,我们进一步使用Ire1α的特异性抑制剂STF-083010,但我们发现STF-083010不能挽救肝细胞分化延迟的表型。以上结果表明gspt1l对于斑马鱼肝脏及其他消化器官的发育是必须的,gspt11~(v28)突变通过UPR抑制肝脏的分化,而且可能是不依赖Ire1αRNase活性的。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q418
【部分图文】：

西南大学硕士学位论文成肝脏原基（Liver Primordium），出芽完成后肝母细胞将恢复上皮细胞的形态(Lemaigre, 2009)。随着侧板中胚层（Lateral Plate Mesoderm, LPM）的不对称迁移(Horne-Badovinac et al., 2003)，出芽后的肝脏原基将会向左生长，肝脏出芽的过程在大约34hpf结束，此时可以在肝脏原基和邻近的食管的连接处看到明显的沟壑。沟壑附近的部分肝细胞具有发育成胆管祖细胞的潜能，随着沟壑的延伸，胆管将逐渐成型以连接肝脏原基和原始消化管(TaoandPeng,2009)。完成出芽后肝脏将进入生长时期，并伴随着肝实质细胞（Hepatocyte）的分化，胆管网络（BiliaryDuctalNetwork）的形成。当斑马鱼发育到 96h 时，肝脏发育成两叶，包含一个较大的左叶和一个较小的右叶，整体呈回旋镖状(Chu and Sadler, 2009)，并可以发挥它的大部分功能。而且有趣的是，和小鼠不同，斑马鱼肝脏的生长是不依赖于血管发生的(Korzh et al., 2008)。

图 2 斑马鱼胰腺发育示意图。在（A）5hpf 时期，紫色区域为内胚层祖细胞。（B）原肠胚后期，胰腺祖细胞在 RA 信号的作用下开始出现。（C）大约 10 体节时期在内胚层中线的位置开始特异性表达 pdx1，（D）在15hpf 时期内分泌胰腺祖细胞开始表达 insulin。（E）24hpf 时期 insulin 阳性细胞出芽。（F）32hpf 时期 ptf1a阳性外分泌胰腺出芽。（G）48hpf 时期内分泌胰腺和外分泌胰腺完成融合。（H）72hpf 时期外分泌胰腺中已经有表达 trypsin。(Tehrani and Lin, 2011)1.3.2 斑马鱼胰腺发育的分子调控机制在原肠作用完成之后，棒状内胚层沿着前后轴发生区域化，区域化决定了特化为胰腺的内胚层细胞的位置，内胚层前后轴区域化的分子机制涉及很多信号通路，其中主要包括来自中胚层的 RA（RetinoicAcid）、Fgfs、Wnt、Bmps 和 Hedgehog（Hh）信号通路。RA 是维生素 A 的衍生物，通过受体 RARs（RA Receptors）参与转录调控。研究表明 RA 的梯度扩散调控多种祖细胞的分化模式(Rhinn and Dolle, 2012)。维生素 A 合成 RA 需要醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase, Aldh）的参与，研究表明 aldh2 缺陷或者使用 RARs 的抑制剂导致早期胚胎内分泌胰腺和外分泌胰腺以及肝脏的缺失，但是不影响其他内胚层器官的特化，进一步研究表明 RA 诱导内

图 3UPR 概况图。（A）适应阶段 UPR：在 UPR 未激活时，BIP 结合在 ATF6 、PERK、IRE1 的内质网腔结构域使它们处于非激活状态，未折叠或当错误折叠蛋白在内质网中的累积导致 BIP 脱离并激活三条通路，当BIP 脱离时，ATF6 会转运至高尔基体通过 S1P 和 S2P 加工成为具有转录因子活性的 ATF6 ，PERK 和 IRE1会分别二聚体化及自磷酸化。活化的 PERK 会磷酸化 eRF2 从而降低总的蛋白翻译并通过 ATF4 激活促进细胞生存的基因，而活化的 IRE1 则通过 XBP1s 及 RIDD 促进细胞生存。（B）适应不良阶段：当内质网压力无法清除时，PERK 的下游基因 CHOP 将会上调 ROS 并诱发凋亡，但 IRE1 诱导的 JNK 和 RIDD 在凋亡中扮演的角色目前还不清楚。良阶段（maladaptive stage）。在适应阶段，UPR 主要通过增加分子伴侣的表达提高内质网蛋白折叠能力，重建蛋白折叠稳态，同时总的蛋白翻译速率下降，减少内质网蛋白输入量。当 UPR 适应期内质网中的未折叠蛋白没有有效清除时，细胞将进入适应不良阶段，在这一阶段细胞内的翻译抑制被解除，生存促进因子的活性下降引起细胞凋亡(HetzandPapa,2018)。很多研究表明 UPR 中的三条支路不会立刻被内质网压力全部激活，ATF6 和 IRE1 通路在内质网压力条件下首先被激活，而且在内质网压力的持续存在的条件下 ATF6 和 IRE1 通路的强度会逐渐衰减。PERK 通路会在 ATF6 和 IRE1 通路后启动，在内质网压力的持续存在的条件下始终保持激活状态(Rutkowski et al., 2006)。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 臧晓霞;纪明山;左平春;陈仕红;孙中华;杜芳;;啶酰菌胺对斑马鱼胚胎及成鱼的毒性[J];农药;2016年12期

2 沈自慧;杨淋清;吴德生;郭昱嵩;袁建辉;周丽;刘建军;庄志雄;;基于斑马鱼胚胎进行化学品毒性评价的方法[J];中国热带医学;2016年12期

3 王鸿奎;巩杰;王新;刘东;;非肌性肌球蛋白Ⅱ-C在斑马鱼胚胎发育过程中的表达[J];交通医学;2016年01期

4 郭樱子;栾亚楠;周玉玲;白承连;任湘鹏;;低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响[J];温州医科大学学报;2016年07期

5 赵崇军;田敬欢;倪媛媛;冯娅茹;代一航;王金凤;樊娇娇;杨冉;马志强;林瑞超;;马钱子对斑马鱼胚胎发育的影响[J];中华中医药学刊;2016年11期

6 刘迎;胡燕;姜蕾;潘波;秦涵淳;林勇;;6种表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];生态毒理学报;2014年06期

7 何秋霞;董贞兰;楚杰;孙桂金;韩利文;韩健;刘可春;;芦荟大黄素对斑马鱼胚胎发育及运动行为学的毒性研究[J];山东科学;2015年03期

8 陈怡君;蒲韵竹;颜慧;钟玉绪;王卓;李春杰;查晓丹;赵宝全;刘萍;;冰片对斑马鱼胚胎发育的安全性评价[J];中国药房;2014年19期

9 刘迎;胡燕;姜蕾;潘波;秦涵淳;林勇;;5种酰胺类除草剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];农药;2014年11期

10 王雪;彭维兵;王希敏;刘可春;陈锡强;张云;;富马酸二甲酯对斑马鱼胚胎早期发育的影响[J];动物学杂志;2013年04期

相关博士学位论文 前10条

1 周作琼;hprg1b基因的干细胞系建立及其作用研究[D];湖南师范大学;2017年

2 祝琴芳;核仁蛋白Rcl1在斑马鱼肝脏发育过程中的功能研究[D];浙江大学;2019年

3 赵纾奕;Sas10和Mpp10的稳定性及其在斑马鱼肝脏发育过程中生物学作用研究[D];浙江大学;2018年

4 展延栋;斑马鱼尾动脉经内皮造血转化产生造血干细胞及前体细胞[D];西南大学;2019年

5 朱楼吟;Ahi1突变通过获得功能性毒性影响斑马鱼视神经投射[D];南昌大学;2019年

6 徐道杰;全麻药对斑马鱼心脏骤停后脑损伤的保护作用及早期暴露影响少突胶质细胞和髓鞘发育的机制研究[D];上海交通大学;2018年

7 户宜;农药暴露对女性生育力及子代神经发育的影响[D];上海交通大学;2018年

8 党垚;模式化学品咪鲜胺暴露下斑马鱼的生殖轴响应及母体传递毒性效应[D];华中农业大学;2019年

9 洪强;Sox3调控斑马鱼卵母细胞发生的分子机制研究[D];武汉大学;2018年

10 陈煜;ERα对斑马鱼卵巢功能维持和Vtg生成的调控机制研究[D];中山大学;2019年

相关硕士学位论文 前10条

1 柳怡楠;斑马鱼前肾突变基因的克隆及wt1a基因敲除[D];西南大学;2019年

2 罗魏;Isoleucyl-tRNA Synthetase在斑马鱼消化器官发育中的功能研究[D];西南大学;2019年

3 韩新卢;Gspt1l在斑马鱼肝脏发育中的功能研究[D];西南大学;2019年

4 梁森;CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因及表型分析[D];重庆医科大学;2019年

5 黄月玥;斑马鱼前肾突变体的遗传筛选及精子冻存[D];西南大学;2019年

6 吴琼;cAMP/PKA通路介导的戊唑醇对斑马鱼性别分化影响的机制研究[D];浙江大学;2019年

7 王宏波;利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼cxxc5a基因敲除品系[D];湖南师范大学;2019年

8 郑静;基于CRISPR/Cas9技术构建自闭症风险基因katnal2斑马鱼突变模型[D];华中科技大学;2019年

9 郑雪丹;Hedgehog信号在斑马鱼牙齿发育及再生中的作用[D];重庆医科大学;2019年

10 万思瑶;stat1b基因突变对斑马鱼胚胎早期发育转录组调控的研究[D];湖南师范大学;2019年

本文编号：2865714