海洋中利用细菌细胞壁肽聚糖关键组分D型丙氨酸及二氨基庚二酸细菌的多样性及酶学研究

发布时间：2020-11-02 15:26

　　 海洋覆盖地球表面70%以上的面积,蕴含着种类多样、数量丰富的微生物。细菌细胞壁肽聚糖是海洋中颗粒有机质(particulate organic matter,POM)的重要组分。D型丙氨酸(D-alanine,D-Ala)是肽聚糖的关键组分,二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP)是革兰氏阴性细菌肽聚糖的特征性组分。海洋环境中,微生物利用D-Ala和DAP的机制,以及能够利用DAP细菌的种类,目前研究并不清楚。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是本实验室从深海沉积物中分离得到的一株可以降解革兰氏阳性菌肽聚糖并能以释放出的D-Ala为唯一氮源生长的菌株。本文对推定的CF6-2利用D-Ala的代谢通路中的三个关键酶进行了异源表达和纯化,并对它们进行了体外功能验证与表征。DAP是革兰氏阴性细菌肽聚糖的特征性组分。本文对西太平洋多个位点不同深度的海水样品中能利用DAP为唯一碳氮源的细菌进行了多样性分析,并从中筛选出了 45株能利用DAP的菌株;本文还分析了其中2株菌株利用DAP的代谢通路。1.深海细菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2利用D-Ala代谢通路中关键酶的体外功能验证与表征前期研究表明,Ps.sp.CF6-2分泌的弹性蛋白酶pseudoalterin能裂解革兰氏阳性菌肽聚糖中D-Ala两端的肽键,释放D-Ala,并能以D-Ala为唯一氮源生长。基因组与转录组分析表明,在Ps.sp.CF6-2利用D-Ala的代谢通路中,D-Ala连接酶0208、Ala消旋酶3059和D-Ala氨基转移酶1756可能起到关键作用。本文对这这些酶的功能进行了体外验证,并对它们进行了表征。D-Ala对于细菌通常具有毒性。我们测定了 Ps.sp.CF6-2以不同浓度的D-Ala为唯一氮源的生长情况,结果表明Ps.sp.CF6-2虽然可以利用D-Ala为唯一氮源生长,但高浓度的D-Ala对Ps.sp.CF6-2的生长仍具有抑制作用,表明Ps.sp.CF6-2利用低浓度D-Ala时可能会先将其转化为其他物质以对抗其毒性。我们对推定的Ps.sp.CF6-2利用D-Ala的关键酶D-Ala连接酶0208、Ala消旋酶3059和D-Ala氨基转移酶1756进行了异源表达和纯化,然后通过体外酶活测定实验验证了它们利用D-Ala的功能,证明D-Ala连接酶0208可以将D-Ala互相连接成为D-Ala-D-Ala二肽,Ala消旋酶3059可以将D-Ala和L-Ala互相转化,D-Ala氨基转移酶1756可以将D-Ala脱氨为丙酮酸,为推定的Ps.sp.CF6-2的D-Ala代谢通路提供了证据。我们还测定了上述酶的米氏曲线等表征。2.西太平洋水样中利用二氨基庚二酸菌株的筛选及多样性分析我们以DAP为唯一碳氮源,对西太平洋A1、A3、A4、A10、B3位点不同深度共16个海水样品进行了富集培养,分析了西太平洋水样中能利用DAP为唯一碳氮源的细菌的多样性,发现西太平洋表层和浅层海水样品中能利用DAP为唯一碳氮源的细菌以Thalassospira、Erythrobacter和Haloryionas为主,而深层海水样品中以Alteromonas、Pseudoaltemomonas、Microbacterium、Thalassospira和Nitratireductor为主。我们使用DAP筛选平板从上述位点的海水样品中筛选出了45株能利用DAP的菌株。3.西太平洋细菌利用二氨基庚二酸的代谢通路研究为了阐明海洋细菌利用DAP的机制,我们选取了2株能利用DAP为唯一碳氮源生长较快的菌株,其中1株革兰氏阳性,1株革兰氏阴性,对它们进行了基因组测序。通过对它们基因组中基因注释的分析,查阅相关的酶学数据库,推测它们主要通过两条途径利用DAP:使用diaminopimelate decarboxylase将DAP转化为赖氨酸,然后进入柠檬酸循环;或使用UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase和UDP-N-acetylmuramoyl-tripeptide-D-alanyl-D-alanine ligase将DAP连接到连接在乙酰基上的短肽上,生成的UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamyl-meso-2,6-diaminopimeloyl-D-alanyl-D-alanine是革兰氏阴性菌细胞壁DAP型肽聚糖的重要原料,可以直接被阴性菌用于自身细胞壁肽聚糖的合成。本论文研究结果初步揭示了海洋细菌代谢D-Ala和DAP的机制,对阐明海洋中细菌驱动的D-Ala和DAP的生物地球化学循环机制具有重要意义。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q936
【部分图文】：

放并利用Ｄ－Ａｌａ；并通过基因组和转录组分析，推测出Ｄ－Ａｌａ在ｓｐ．?ＣＦ６－２??代谢通路中的关键酶：Ｄ－Ａｌａ连接酶０２０８、Ａｌａ消旋酶３０５９和Ｄ－Ａｌａ氨基转移??酶１７５６?（Ｙａｎｇ，２０１７）（图１－２）。但这些酶的活性与功能尚未验证。??１６??

０１２３４５６７８??Ｔｉｍｅ?（Ｄａｙ）??图２－１以不同浓度Ｄ－Ａｌａ为唯一氮源培养ＣＦ６－２时的生长情况。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１．?Ｇｒｏｗｔｈ?ｏｆ?ＣＦ６－２?ｗｉｔｈ?Ｄ－Ａｌａ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ａｓ?ｓｏｌｅ?ｎｉｔｒｏｇｅｎ?ｓｏｕｒｃｅ．??ＣＦ６－２?ｉｎ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ＣＦ６－２?ｉｎ?２?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ｊ?ＪＪｇ?ＣＦ６－２?ｉｎ?４?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??０１８：?ＣＦ６－２?ｉｎ?６?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ＣＦ６－２?ｉｎ?１０?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ＣＦ６－２??ＣＦ６－２?２０?ｍＭ??〇?０．０８－??〇．〇ｅ：??０．００?丄ｎ?＾???７．２?７．４?７．６?７．８?８．０??Ｔｉｍｅ?（Ｄａｙ）??图２－２?ＣＦ６－２以不同浓度Ｄ－Ａｌａ为唯一氮源生长１８４

图２－１以不同浓度Ｄ－Ａｌａ为唯一氮源培养ＣＦ６－２时的生长情况
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本文编号：2867219