基于CRISPR-Cas的肺炎克雷伯杆菌的噬菌体抗性：生物信息学分析和工程菌构建

发布时间：2020-11-05 00:21

　　 噬菌体感染是微生物发酵工业面临的一个棘手问题,至今仍无良策。本研究致力于探索基于CRISPR-Cas技术的噬菌体感染问题的解决方案。本文以肺炎克雷伯杆菌为例,从噬菌体的分离与分析开始,探究了天然CRISPR-Cas系统与(前)噬菌体之间的相互作用关系,建立了基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术,探索了增强CRISPR-Cas9的噬菌体抗性水平的方法。本文的研究既包括利用公共数据库中的资源从生物信息学的角度进行的理论分析,也有从实验的角度对相关问题进行的探索论证。主要研究结果如下:首先,对感染肺炎克雷伯杆菌工业发酵菌株的噬菌体进行了分离、生理特性和基因组分析,并考察了噬菌体感染对1,3-丙二醇发酵过程的影响。系统进化树的分析结果显示,噬菌体phiKpS2属于Kp34属肺炎克雷伯杆菌噬菌体,是一类在自然界分布广泛的克雷伯杆菌噬菌体。发酵实验表明,噬菌体感染会导致发酵长时间停滞,发酵周期延长,生产效率降低。此外,发现噬菌体感染对细胞生长和代谢的影响与感染时细胞所处生长阶段有密切关系。其次,对肺炎克雷伯杆菌的CRISPR-Cas系统和前噬菌体进行了系统的生物信息学分析。鉴定出了一种新的Ⅰ型CRISPR亚型,命名为I-E*,并对其基本特征包括在染色体上的位置、基因的组织结构、Cas蛋白、tracrRNA的结构、PAM位点和进化来源等进行了确定;CRISPR间隔序列主要来源于噬菌体、前噬菌体和质粒,提示其主要功能是防止外来遗传元件入侵。揭示了前噬菌体是肺炎克雷伯杆菌基因组可塑性的重要原因之一;在全球范围内流行的CG258型菌株含有较多高度保守的前噬菌体,包括其特有的两个P2-P4噬菌体系统;肺炎克雷伯杆菌染色体上的获得型抗生素抗性基因(aARGs)集中存在于CG258型和CRISPR 阳性菌株中,其中CG258型菌株的aARGs有60%位于前噬菌体区域,而CRISPR 阳性菌株的aARGs仅有10%位于前噬菌体区域,显示CRISPR-Cas系统和CG258的前噬菌体可能分别独立地参与了ARG在染色体上的整合。发现CRISPR-Cas系统和前噬菌体的分布都依赖与菌株的MLST分型,且CRISPR中存在高比例的自我靶向的间隔序列:这些可能是在肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统对前噬菌体的存在影响有限的原因。接着,对5株潜在肺炎克雷伯杆菌工业菌株的前噬菌体诱导性进行了检测,对其中一株菌的前噬菌体诱导过程进行了定量分析,并对诱导出的两个前噬菌体进行了全基因组分析。实验结果显示,肺炎克雷伯杆菌在丝裂霉素C(MMC)诱导下易发生前噬菌体大量增殖,细胞裂解死亡。其中,肺炎克雷伯杆菌W3的基因组中有2个可诱导的前噬菌体,且存在自发诱导现象。诱导出的噬菌体PKPW3.1和PKPW3.3在NCBI phage数据库中没有同源噬菌体,说明是新的噬菌体类型。对前噬菌体携带的tRNA分析显示,PKPW3.1和PKPW3.3中含有三种tRNA(tRNA-Arg,tRNA-Asn,tRNA-Thr),是肺炎克雷伯杆菌前噬菌体中最常见的tRNA类型。前噬菌体在基因组中的高丰度、可诱导性及自发诱导性,说明在以肺炎克雷伯杆菌为基础的发酵工业中前噬菌体是导致噬菌体感染的风险因素之一。然后,建立了一种基于CRISPR-Cas9的肺炎克雷伯杆菌噬菌体基因组编辑技术。揭示了30-60 bp的短同源臂可以高效地实现包括点突变、基因删除和插入、移码突变在内的多种遗传操作,从而大大简化了基于CRISPR-Cas的噬菌体基因组编辑中繁琐的模板构建过程。通过对177个sgRNA的预测活性与实际测定活性的相关性分析,证实来源于真核生物的sgRNA预测模型不能用来预测针对噬菌体的sgRNA活性。揭示了低活性的sgRNA也可以用来进行基于同源重组的噬菌体基因组编辑,通过移码突变可以快速的判断噬菌体基因的必需性;并以噬菌体phiKpS2为例,通过移码突变和基因删除等,对其17%的基因的必需性进行了初步验证。最后,分析了针对噬菌体的sgRNA的活性分布,考察了噬菌体从单一靶标和多靶标CRISPR-Cas系统中逃逸的机制,发现通过表达Mu Gam干扰噬菌体DNA双链断裂修复可显著增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性。在针对噬菌体的sgRNA中,活性低的sgRNA数量较多。在177个sgRNA中,活性最低的那部分,即EOP0.1的sgRNA约占49.7%,而EOP10-4,即活性最高的那部分sgRNA仅占4.5%。噬菌体有多种逃逸CRISPR-Cas系统的方式,包括非同源末端接合、同源重组和靶向区域的大片度删除。5个sgRNAs串联的多靶标CRISPR-Cas系统可促进靶向区域的大片段删除,但没有显著增强菌株的噬菌体抗性。发现Mu Gam蛋白可显著增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性,且这种增强效应对不同活性的sgRNA均适用。表达Mu Gam后噬菌体逃逸的方式发生了改变,逃逸噬菌体中野生型和发生靶向区域大片段删除的突变体都增加了。未来在对肺炎克雷伯杆菌发酵菌株选育的过程中需要进行前噬菌体的诱导性检测,或考虑开发基于CRISPR-Cas系统的前噬菌体清除技术;另外,通过对噬菌体双链断裂修复机制的深入研究,未来可以设计更好的干扰策略来防止噬菌体逃逸。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;Q811.4
【部分图文】：

宿主逃过噬菌体的捕食，而新的噬菌体突变体又会继续威胁着宿主的安全。在这一过程??中，宿主的噬菌体抗性机制和噬菌体的适应机制扮演着重要的角色。噬菌体和细菌的作??用机制如图１．１所示。??１．１．３．１宿主的噬菌体抗性机制??从免疫学的角度看，细菌的噬菌体抗性机制可以分为两大类：固有免疫和获得性免??疫［２５］。前者出现在噬菌体生活史的各个阶段，包括阻止噬菌体吸附、阻止ＤＮＡ注入、??剪切噬菌体核酸和流产感染系统。后者主要针对噬菌体的核酸，目前在细菌中发现了??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ和ｐＡｇｏ两种获得性免疫系统［２５］。??噬菌体吸附是其感染的第一个阶段，细菌可以通过几种方式来阻止噬菌体吸附，包??括吸附受体的丢失或表达下调，受体的突变和受体的空间阻遏［２１］。阻止噬菌体ＤＮＡ注??入一般是通过超感染排斥蛋白来完成的［２６］，这类蛋白常常由前噬菌体编码。而当噬菌体??的核酸注入细胞后，限制性修饰系统会对其进行剪切，从而破坏噬菌体感染。另外，也??有些细菌在感染噬菌体后会启动程序性死亡

图１．３基于传统的基因工程的噬菌体抗性菌株构建策略ｉ２１，１２２］。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ?ｏｆ?ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ?ｇｅｎｅｔｉｃ?ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ?ｔｏ?ｉｎｃｒｅａｓｅ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ??ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｆｏｒ?ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．??３基于ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统的噬菌体抗性策略??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统是ＲＮＡ引导的细菌的获得性免疫系统，可用来对抗外来遗传物质??侵［３１］。仅需改变２０ｂｐ左右的核酸序列就可以实现ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统的特异性切割，??该系统可以方便地用来进行核酸修饰。然而，尽管ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统是在研宄工业??－１５?－??

图１．４本文的主要研究内容??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ｏｕｔｌｉｎｅ?ｏｆ?ｔｈｉｓ?ｒｅｓｅａｒｃｈ??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 南南;曹放;沈俊涛;绳傲楠;孙亚琴;牟英;修志龙;;一株产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌的噬菌体生物学特性[J];微生物学报;2013年09期

本文编号：2870827