家蚕滞育相关基因的表达分析及功能鉴定

发布时间：2020-11-05 10:42

　　 大多数动物在遇到不利的生存条件时会延迟发育并进入生长发育停滞的休眠状态,这为其生命延续提供保障。例如:北极熊、青蛙、刺猬等通过休眠过冬;海参、非洲肺鱼、箭猪等通过休眠度过炎热的夏季。本研究关注的昆虫滞育也属于一种休眠类型,滞育是生物体渡过周期性的不利于其生存环境条件的一种策略,它是昆虫度过不良生活条件的一种重要的生理特性。根据昆虫滞育发生的时间,可以将其分为以下四种类型:卵滞育(胚胎滞育)、幼虫滞育、蛹滞育、成虫滞育。家蚕由于其独特的历史文化和经济价值,长期以来都是研究者关注的实验模型。本研究以二化性家蚕品系Dazao为实验对象研究家蚕胚胎滞育,二化性家蚕子代滞育受亲代胚胎所处环境温度与光照影响,25℃长光照下孵育的蚕卵化蛾后产下滞育卵,15℃黑暗下孵育的蚕卵化蛾后产下非滞育卵。家蚕滞育分子机制的研究有助于扩大蚕业生产,提高产业效率,同时在农林业害虫防治方面具有重大意义。本研究通过不同条件下孵育的Dazao胚胎反转期和点青期的转录组测序,筛选滞育相关基因,并研究这些滞育相关基因在一化和二化性家蚕胚胎期的表达模式,最后通过RNAi技术鉴定这些基因的功能。主要研究结果如下:1.Dazao胚胎反转期和点青期的转录组测序分析为了研究亲代胚胎是如何接受外界环境刺激,并最终影响子代滞育这一问题,我们对注定产滞育卵25℃长光照下孵育胚胎和注定产非滞育卵15℃暗光照下孵育胚胎的反转期和点青期进行转录组测序。转录组分析结果显示:差异基因分析在胚胎反转期(BK25 vs BK15)鉴定到812个显著上调表达基因,65个显著下调表达基因;在胚胎点青期(HP25 vs HP15)鉴定到201个显著上调表达基因,232个显著下调表达基因。GO和KEGG分析显示差异基因涉及Phototransduction–fly,Amino sugar and nucleotide sugar metaboli,Glycosaminoglycan degradation等代谢通路。此外,胚胎反转期和点青期的聚类分析得到共同差异表达基因44个,包括32个共同上调表达基因和12个共同下调表达基因,这些差异基因的注释涉及膜结构成分,催化活性,结合蛋白以及代谢进程。随机选取16个差异表达基因,通过qRT-PCR来验证RNA-Seq的准确性,结果显示其中15个差异基因表达上下调与转录组结果一致,证明测序数据的可靠性。转录组测序结果分析结合前人研究,我们鉴定到七个滞育候选基因,包括三个热激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614;两个节律基因BGIBMGA000486(period),BGIBMGA003345(takeout);两个TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273。2.滞育相关基因在一化和二化性品系家蚕胚胎期表达模式本实验选取一化性家蚕品系C-4,二化性家蚕品系皓月(HY)和秋丰(QF)为实验对象,将解除滞育的蚕卵分别在25℃光照条件下和15℃黑暗条件下孵育并取材,直至孵化。利用qRT-PCR检测七个滞育相关基因在这三个品系家蚕胚胎期的表达模式。结果显示,三个热激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614在二化性品系皓月(HY)和秋丰(QF)中具有相似的胚胎期表达模式:它们在25℃明催青和15℃暗催青两种条件下具有显著差异表达,表现为在15℃暗催青条件下的表达量显著高于25℃明催青条件下的表达量,而在一化性品系C-4中没有显著差异;滞育相关基因BGIBMGA000486和BGIBMGA003345在二化性品系皓月(HY)和秋丰(QF)的胚胎发育中后期25℃明催青条件下的表达量显著高于15℃暗催青条件下的表达量,而在一化性品系C-4中没有差异;两个TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273在二化性品系皓月(HY)和秋丰(QF)中也具有相似的胚胎期表达模式,它们在胚胎发育前期25℃明催青条件下的表达量高于15℃暗催青条件下的表达量,而在一化品系C-4中没有差异。根据这七个滞育相关基因在一化和二化性品系胚胎期的差异表达模式,我们推测这些基因可能通过调节表达量的方式参与家蚕滞育调控。节律基因和TRP家族基因在25℃明催青条件下的显著上调表达可能是其调控家蚕滞育的原因,热激蛋白在低温(15℃)下的显著上调表达可能是影响产下非滞育卵的原因。3.滞育相关基因的功能鉴定根据转录组的结果分析和差异基因在一化和二化性品系胚胎期的差异表达模式,我们推测节律基因BGIBMGA000486(period),BGIBMGA003345(takeout);TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273在25℃明催青条件下的显著上调表达可能是其调控家蚕滞育的原因,此外,热激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614在低温(15℃)下的显著上调表达可能是影响产下非滞育卵的原因。因此我们进一步利用RNAi技术,在个体水平上验证这些基因的功能。我们对刚产下的二化性家蚕Dazao非滞育卵进行滞育相关基因的dsRNA注射,并以红色荧光蛋白基因Red和未作任何处理的蚕卵作为对照。将注射14536-dsRNA、14618-dsRNA、4614-dsRNA的蚕卵置于15℃黑暗条件下孵育,注射3345-dsRNA、486-dsRNA、9272-dsRNA、9273-dsRNA的蚕卵置于25℃光照条件下孵育,注射dsRed和未经任何处理的蚕卵作为对照组均分在两种条件下孵育,等待化蛾产卵后,统计子代滞育情况。当前本部分实验正在进行中,结果有待统计。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q963
【部分图文】：

促使蚕卵胚胎解除滞育而进入胚胎发育阶段[60]。育与生物节律的研究的滞育是一种世代节律现象，光照和温度是影响家蚕滞育的重要因素是生物钟基因表达的重要授时因子，因此家蚕滞育与生物节律调控具有。昆虫生物钟在果蝇（Drosophila melanogaster）中的研究较为透彻，律是通过一个核心反馈环路来调节：节律基因 PER 和 TIM 结合成二聚细胞核，其结合到转录因子 CLK 和 CYC 的增强子上来反馈调节自身时光照可通过 CRY 降解 PER-TIM 二聚体，消除对转录因子 CLK 和 CY用，形成一个完整的反馈环路[61-64]。昆虫滞育的研究显示，节律基因与昆虫滞育有着紧密的联系。例如，Culex pipiens）干涉 period，timeless 和 CRY2，可以阻止尖音库蚊进入而干涉 PDF（pigment dispersing factor）会得到相反的效果（图 1.1）[65]；（Riptortus pedestris）中干涉生物钟基因 period 和 CRY2，能够使本该成虫正常发育[66]。

图 3.1 差异基因火山图Figure 3.1 Volcanic map of differentially expressed genes3.3.4 反转期和点青期共同差异基因分析滞育诱导是一段持续的时期，短暂的温度变化不能影响子代滞育状况，因此，反转期与点青期的聚类分析有助于筛选起持续作用的滞育相关基因，通过对这两个时期执行聚类分析，结果获得共同差异表达基因 44 个，包括 32 个共同上调表达基因和 12 个共同下调表达基因（表 3.5），差异基因的注释主要涉及膜结构成分，催化活性，结合蛋白以及代谢进程等。表 3.4 反转期和点青期共同差异基因Table 3.4 Gene analysis of common differences between blastokinesis phase and head pigmentation phaseExpression difference Gene_id Gene_descriptionUP- regulated BGIBMGA009047 Kazal domainBGIBMGA002624 Domain of unknown function DUF4773BGIBMGA014323Enolase C-terminal domain-like||Mandelate racemase/muconatelactonizing enzyme, N-terminal domainBGIBMGA007856 Alpha/beta hydrolase fold-3||Alpha/Beta hydrolase fold

第 3 章 不同温度下二化性家蚕胚胎反转期和点青期转录组测序分析3.3.5 差异表达基因的 GO 分析Gene Ontology（简称 GO）是基因功能国际标准分类体系。根据实验目的筛选特异差异基因后，研究差异基因在 Gene Ontology 中的分布状况，有助于阐明实验中样本差异在基因功能上的体现。GO 富集分析方法为 GOseq[109],此方法基于Wallenius 非中心超几何分布（Wallenius non-central hyper-geometric distribution）。相对于普通的超几何分布(Hyper-geometric distribution)，该分布的特点是从某个类别中抽取个体的概率，它不同与从某个类别之外抽取一个个体的概率，这种概率的不同是通过对基因长度的偏好性进行估计得到的，这种方法能更为准确地计算出 GO term 被差异基因富集的概率。GO term 包括三种基本分类：生物学过程（CC），细胞成分（BP）和分子功能(MF) 。GO 富集结果如图 3.2 和图 3.3
【参考文献】

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本文编号：2871522