Ahi1突变通过获得功能性毒性影响斑马鱼视神经投射

发布时间：2020-11-06 18:02

　　 AHI1基因广泛地存在于自然界中的多种生物中,从鱼类、小鼠到灵长类生物以及人类均存在AHI1基因。人类的AHI1蛋白包含三个结构域,N端的Coiledcoil结构域,中端的WD40重复结构域,以及C端的SH 3结构域,其中WD40重复结构域与SH3结构域较为保守,在多种动物的AHI1蛋白中共同存在。AHI1与脑神经组织的发育有着密切的联系,AHI1基因突变可引起早期脑部发育障碍的朱伯特综合症(Joubert Syndrome)发病,然而具体病理机理仍不清楚。相较于小鼠,斑马鱼的Ahi1蛋白结构与人类更加相似,故我们利用斑马鱼作为动物模型研究ahi1在早期脑部发育中的作用。通过原位杂交技术发现ahi1在斑马鱼胚胎发育早期已经存在表达,并且大量特异地表达在斑马鱼幼鱼头部的各个组织中。而后随着发育时间的推移,ahi1在斑马鱼头部的表达量逐渐减少。我们向单细胞时期的斑马鱼胚胎中注射反义吗啉代寡核苷酸(morpholino)敲减ahi1的表达,通过反转录PCR发现在morpholino注射后的胚胎中产生了缺失两个外显子的ahi1 mRNA。并且观察到注射后的胚胎在发育到第四天时已经出现了视神经投射异常的现象,其中包括视神经穿越中线异常和视神经生长延伸异常,同时眼组织面积也出现了显著的减小。通过p53 morpholino和control morpholino分别与ahi1 morpholino的共注射,我们确认了这种通过ahi1敲减导致的斑马鱼幼鱼出现的视神经投射异常及眼组织面积减小的表型是特异的,而非由于morpholino的毒性或是注射损伤造成。由于我们发现在Ahi1 null的斑马鱼幼鱼中并未出现类似上述的视神经投射异常和或眼组织面积减小的表型,于是决定利用CRISPR-Cas9技术在ahi1morpholino作用位点附近设计了两个敲除位点,并创造了一批模拟morpholino作用的临近位点突变或缺失的Ahi1 truncated的斑马鱼。检测这些Ahi1 truncated斑马鱼幼鱼后发现,它们中出现了高比例与morpholino注射后相似的视神经投射异常及眼组织面积减小的表型。由此推断truncated Ahi1蛋白由于在WD40结构域部分氨基酸缺失,导致产生了获得功能性毒性,并因此造成斑马鱼在早期发育时出现视神经投射异常和眼部组织面积减小的现象。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q436
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 引言
    1.1 AHI1基因与AHI1蛋白
        1.1.1 AHI1基因
        1.1.2 AHI1蛋白
        1.1.3 AHI1蛋白与纤毛结构
    1.2 AHI1基因与信号通路
        1.2.1 AHI与WNT/β-catenin信号通路
        1.2.2 AHI与BDNF/TrkB信号通路
        1.2.3 AHI与摄食行为
    1.3 AHI1基因与疾病
        1.3.1 AHI1与朱伯特综合症
        1.3.2 AHI1与自闭症
        1.3.3 AHI1与精神分裂症
        1.3.4 AHI1与情感性精神障碍
        1.3.5 AHI1与多发性硬化
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 实验器材
        2.1.3 实验药品
        2.1.4 分子实验试剂
    2.2 实验器材、药品与试剂
        2.2.1 胚胎Morpholino注射及培养
        2.2.2 斑马鱼总RNA的提取
        2.2.3 斑马鱼总cDNA的制备
        2.2.4 TA克隆与转化
        2.2.5 扩大培养与阳性克隆的选择
        2.2.6 CRISPR-Cas9与gRNA的注射
        2.2.7 斑马鱼基因敲除检测实验
        2.2.8 RNA探针的制备
        2.2.9 原位杂交实验
        2.2.10 胚胎免疫荧光染色
        2.2.11 幼鱼的视神经注射及投射观察
第3章 实验结果与分析
    3.1 AHI1蛋白在不同物种间的结构差异
    3.2 ahi1基因在斑马鱼中的时空表达
    3.3 ahi1Morpholino的敲减效力验证
    3.4 ahi1敲减引起斑马鱼视神经投射异常
        3.4.1 ahi1 morpholino注射后引起两种视神经投射异常
        3.4.2 ahi1 morpholino与WT视神经异常幼鱼数量对比
        3.4.3 ahi1 morpholino引起幼鱼平均视神经投射长度缩短
        3.4.4 ahi1 morpholino引起幼鱼平均眼组织面积减小
        3.4.5 单眼数据二维点状分布图
    3.5 ahi1敲减致视神经投射异常表型具有特异性
        3.5.1 ahi morpholino引起的异常表型是特异的
        3.5.2 ctrl或p53 morpholino注射不引起视神经投射异常
        3.5.3 ctrl morpholino与视神经长度及眼组织面积
        3.5.4 p53 morpholino与视神经长度及眼组织面积
        3.5.5 ctrl与p53 morpholino的比较
    3.6 Ahi1 null斑马鱼视神经投射正常
    3.7 ahi1敲除斑马鱼品系的建立
    3.8 ahi1敲除品系斑马鱼视神经投射异常
第4章 结论与展望
    4.1 结论
        4.1.1 ahi1基因与斑马鱼早期视神经投射过程相关
        4.1.2 ahi1morpholino特异性导致视神经投射异常
        4.1.3 截短的ahi1蛋白会导致斑马鱼视神经投射异常
    4.2 讨论
    4.3 进一步工作方向
第5章 总结
致谢
参考文献

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本文编号：2873472