冰岛硫化叶菌REY15A中过氧化物还原酶的性质鉴定和初步遗传分析

发布时间：2020-11-13 10:55

　　 所有的好氧生物都需要面临“如何维持细胞内氧化还原稳态”这一问题。氧自由基(reactive oxygen species,ROS)包括过氧化氢、超氧阴离子自由基、羟基自由基和单线态氧,是造成细胞内氧化压力过大的重要原因之一,会导致生物大分子(蛋白质、DNA和脂类)受损,进而影响细胞生长。细胞内的ROS水平既受细胞内的新陈代谢影响,又受细胞生长微环境的影响。目前已知的能够清除ROS的蛋白酶包括过氧化氢酶、过氧化物还原酶(Peroxiredoxins、Prxs)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,Gpxs)和一些依赖金属离子进行氧化还原反应的酶,而Prxs因为其催化中心结构的特殊性,对过氧化物更敏感,反应更迅速,因此在维持细胞内的氧化还原稳态发挥着重要的作用。相比于其他的能够清除ROS的蛋白酶,人们对于Prxs的研究起步较晚,并且研究对象主要集中在真核生物,尤其是哺乳动物领域,对于古菌中的Prxs研究较少。而冰岛硫化叶菌REY15A作为一种嗜热嗜酸的泉古菌,其细胞内的Prxs是否具有特殊的性质和功能尚未可知。因此本课题开展了冰岛硫化叶菌REY15A中的Prxs性质鉴定和功能分析。首先,我们通过生物信息学分析,找到了冰岛硫化叶菌REY15A中7种被注释(预测)的Prxs,分别是SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725、SiRe_0977、SiRe_1643、SiRe_2162、SiRe_2592,其中 SiRe_1643和 SiRe_2162是类Prxs家族,本课题没有开展进一步研究。我们分析了其余5种Prxs在古菌中的保守性,预测它们的活性位点。通过序列比对,我们发现SiRe_0067、SiRe 0346、SiRe_0725和SiRe_2592在古菌中的保守性较强,并且它们的催化位点满足PXXXT/SXXCp(Cp是催化活性位点的半胱氨酸)的序列。然后,构建了在大肠杆菌与硫化叶菌中蛋白表达的质粒,表达纯化了野生型和活性缺失突变Prxs。接下来,我们对这些Prxs的体外性质进行了鉴定,以过氧化氢和叔丁基过氧化氢为底物,鉴定了这5种Prxs蛋白是否具有过氧化物酶活性并比较还原能力强弱的差异,结果发现SiRe_0346、SiRe_0067与SiRe 2592能够与过氧化氢和叔丁基过氧化氢发生氧化还原反应,具有较强的反应活性,而且C42是SiRe_0067的催化活性位点,C45/50是SiRe_2592的催化活性位点。以单链DNA、双链环状DNA、双链线性DNA为底物,鉴定这些蛋白是否具有与DNA相结合的能力以及影响其与DNA结合的因素分析,我们发现SiRe_0067和SiRe_0067-C42S(活性缺失突变体)能与DNA结合,SiRe_0067的氧化还原状态能够影响其DNA结合能力,被过氧化氢氧化后的SiRe_0067不能与DNA结合。鉴定了这些Prxs是否能够保护DNA免受羟基自由基(ROS中毒性最强的活性氧自由基)的损伤,我们发现SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725和SiRe_2592能够在一定程度上保护DNA免受羟基自由基的攻击,其中SiRe_0346的保护能力最强。接着,我们通过体内过表达这5种Prxs,分析蛋白过表达是否会对细胞生长造成影响,我们发现只有SiRe_0067过表达会使细胞生长趋势变慢,其余Prxs过表达对细胞生长没有明显影响。鉴定当细胞遭受氧化压力时,Prxs蛋白的过表达能否保护细胞免受氧化损伤,我们发现SiRe_0346展现出了较强的保护细胞免于氧化压力的作用。最后,对基因组上编码的Prxs的C末端原位添加6×组氨酸标签,通过Western-Blot实验进一步分析Prxs在正常状态下的细胞内的含量差异以及当细胞遭受氧化压力时,Prxs的表达水平的变化。在体外性质鉴定的实验中,SiRe_0346展现出了能够高效地还原过氧化氢、叔丁基过氧化氢和羟基自由基的反应活性;在体内实验中,SiRe_0346能够在一定程度上提高细胞抵抗氧化压力的能力,由此,我们认为SiRe_0346在冰岛硫化叶菌REY15A中是维持细胞内氧化还原稳态的主要Prxs,而这一结果也与Sulfolobus bolfatarocus P2被UV处理后,SS02121(SiRe_0346的同源蛋白)的转录水平翻倍相符合。在体外实验中,SiRe_0067与SiRe_2592也展现出了一定的清除过氧化物和自由基的能力,因此它们很可能在冰岛硫化叶菌REY15A中作为备份蛋白存在,当SiRe_0346不能发挥作用时能够保持细胞免受氧化压力的损伤。考虑到SiRe_0067的独特性质,作为Prxs中唯一一个具有DNA结合能力,并且唯一一个过表达后能够影响细胞生长的蛋白,我们推测SiRe_0067可能参与到细胞内的氧化信号传导途径,而SiRe_0067的氧化还原状态能够参与调节其功能。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q936;Q933
【部分图文】：

据ＣＲ存在与否与反应机理的差异对Ｐｒｘｓ的分类。ＰｒｘｓＣｙｓ?（ａ），非典型的?２－Ｃｙｓ?（ｂ）与?１－Ｃｙｓ?Ｃｃ）??１?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｒｅｓ?ａｃｃｏｒｄｉｎｇ?ｔｏ?ｗｈｅｔｈｅｒ?Ｃｒ?ｅｘｉｓｔｓ?ｏｒ?ｎｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．?Ｐｒｘｓ?ｉｎｃｌｕｄｅ?２－Ｃｙｓ?（ａ）．?ａｔｙｐｉｃａｌ?２－ＣｙＣｙｓ?（ｃ）??，根据过氧化氢在细胞内的含量以及扮演的角色，Ｐｒｅ。首先，当过氧化氢含量过高，能够对细胞造成损伤还原，降低其毒害作用，维持细胞稳态６Ｑ。其次，当中作为信号分子或是第二信使，进而引发下游反应时，信号的传递者“，因为Ｐｒｘｓ与过氧化氢有着较高的亲应速度与敏感度远远高于“下游蛋白”，被氧化的Ｐｒｘｓ是一种更为有效的“氧化信号传导机制？。而且，据６２

００６７－Ｃ４２Ｓ－ｎｏ－ｈｉｓ，以及冰岛硫化叶菌??表达质粒?ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ＿２５９２－ｎｏ－ｌｉｉｓ、ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ—２５９２－Ｃ－ｈｉｓ、ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ—２５９２－??Ｃ４５／５０Ｓ－Ｃ－ｈｉｓ，图３．１显示构建的质粒经过酶切验证的结果，并且以下所有质??粒都测序验证正确。其中基因片断的长度如下：５０＾＿００６７为４５０匕卩，??ＳｉＲｅ＿０３４６Ｓ?６４８?ｂｐ，ＳｉＲｅ＿０７２５?Ｓ４６２?ｂｐ，ＳｉＲｅ＿０９７７Ｓ?４３２?ｂｐ，?ＳｉＲｅ＿２５９２??为?４７１?ｂｐ。??我们所选用的大肠杆菌表达载体ｐＥＴ２２ｂ?（质粒示意图参见附录八），全长??５４９３?ｂｐ，插入目的基因的位置在多克隆位点的ＴＷｆｅｌ?（２８８）与＆／／Ｉ?（１７９）??之间。冰岛硫化叶菌的表达质粒ｐＳｅＳＤ?（参见附录八），全长８４３４?ｂｐ，目的基??因插入在ＡＷｅｌ?（７７）与＆／Ｉ?（１８４）之间。??ｌｌｉｌｉｉ?ｉｆ??图３．１表达质粒的酶切验证结果??Ｆｉｇ．?３．１?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ??ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??图３．１表示当质粒构建完成后用ＡＷｅ?Ｉ与■＆／１进行双酶切验证的结果

（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ?２００）分离纯化之后得到纯的ＳｉＲｅ＿００６７－ｎｏ－ｌｉｉｓ蛋白。图３．２Ａ表示??分子筛分离得到图谱，图３．２Ｂ是对图３．２Ａ中的第８－１３管ＳＤＳ－ＰＡＧＥ验证结果，??其中Ｃ表示样品经过阳离子交换柱分离，浓缩之后得到的蛋白。浓缩９－１３管，??液氮冻存，－８０°Ｃ保存。??３．３．２．２从大肠杆菌中纯化ＳｉＲｃ＿００６７－Ｃ４２Ｓ??同ＳｉＲｅＪＫ＾Ｔ－ｎｏ－ｈｉｓ的纯化过程类似，热处理之后的上清样品经过阳离子??交换柱和分子筛分离纯化之后得到纯的活性缺失突变体蛋白ＳｉＲｅ＿００６７－Ｃ４２Ｓ。??２２??
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1 钟晴;冰岛硫化叶菌REY15A中过氧化物还原酶的性质鉴定和初步遗传分析[D];山东大学;2019年

本文编号：2882112