嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是重要益生菌,其功能开发及应用倍受关注。前期研究发现,嗜酸乳杆菌GIM 1.208对刺梨果汁有较好的发酵品质特性,特别是产β-葡萄糖苷酶活性显著,对刺梨黄酮苷元——槲皮素有明显释放功能,但相关机制尚不清楚。因此,本研究选用嗜酸乳杆菌GIM 1.208为发酵菌株,首先对刺梨发酵产酶培养基及发酵产酶条件进行优化,进而利用分子生物学法探究蛋白质的理化性质及其一、二级结构等信息。同时,利用基因克隆技术扩增目的基因片段对其进行异源表达、纯化,并利用圆二色谱法探究其二级结构。此外,对嗜酸乳杆菌GIM 1.208产β-葡萄糖苷酶与重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行了初步比较分析。最后,采用荧光光谱、紫外吸收光谱及同步荧光光谱法,探究槲皮素糖苷底物芦丁(Rut)和异槲皮素(Iso)与重组β-葡萄糖苷酶的结合方式,Rut和Iso对β-葡萄糖苷酶的淬灭作用机制,以及二者对该蛋白构象变化的影响。具体内容及结果如下:1、嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶发酵条件研究探究碳源、诱导物和初始pH单因素试验,进而进行L_9(3~4)正交试验优化嗜酸乳杆菌发酵产酶培养基。结果表明:影响嗜酸乳杆菌GIM 1.208产β-葡萄糖苷酶的主次顺序为:诱导物碳源初始pH值,最佳发酵产酶培养基为:葡萄糖3%(v/w)、羧甲基纤维素钠0.4%(v/w)、初始pH值为5.5,得到的酶活为11.684(U/mL.min),较未优化前提高了17.20%。通过发酵温度、发酵时间、料液比、接种量单因素试验,从中筛选影响嗜酸乳杆菌发酵产酶的显著因素,并用Box-Behnken试验优化发酵产酶条件。结果表明:发酵温度、料液比和接种量对嗜酸乳杆菌产β-葡萄糖苷酶影响显著(P0.05),最佳发酵产酶条件为:葡萄糖3.0%(v/w),羧甲基纤维素钠0.4%(v/w),初始pH值为5.5,发酵温度31℃,发酵时间24 h,接种量为2.5%(v/w),料液比为1:4(v/v),发酵所得酶活为16.8046 U/mL.min,较未优化前提高了12.06%。通过验证预测模型,实测值与理论值相差0.08%,该模型能够真实反应嗜酸乳杆菌产β-葡萄糖苷酶的情况。2、生物信息学法探究β-葡萄糖苷酶的结构特性(1)β-葡萄糖苷酶的编码基因序列分析通过基因克隆技术,得到β-葡萄糖苷酶的编码基因序列并对其进行序列分析。结果表明:β-葡萄糖苷酶的编码基因序列为1278 bp,由426个氨基酸组成,其中Asp(D)和Lys(K)在该编码氨基酸序列中使用频率最高,分别为8.5%和8%,其次是Iie(L)和Gly(G)分别为7.7%和6.6%,His(H)使用频率最低,为0.7%。(2)β-葡萄糖苷酶的理化性质分析利用NCBI数据库在线分析工具,对编码β-葡萄糖苷酶的核酸序列进行理化性质分析。结果表明:β-葡萄糖苷酶的总亲水性平均值为-0.455,pI值为5.43,属于酸性蛋白。该蛋白负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)为60个,带正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为54个。其氨基酸序列的不稳定系数为39.85,判定该蛋白具有稳定性。(3)β-葡萄糖苷酶的一级结构分析通过在线分析工具,预测分析β-葡萄糖苷酶的亲/疏水性并预测分析其跨膜结构域,得到该蛋白亲水性较强;预测分析其信号肽信息以及预测分析其磷酸化位点,得到S值小于分泌型蛋白阈值0.5;该蛋白质含有39个磷酸化位点;该酶位于细胞膜。因此,初步推测该酶位于细胞膜,属于可溶性非分泌型蛋白,亲水性较强且无信号肽、可能存在跨膜结构域,具有多个磷酸化位点。(4)β-葡萄糖苷酶的同源序列比对分析及系统发育树的构建与分析将嗜酸乳杆菌β-葡萄糖苷酶的编码氨基酸序列输入NCBI数据库中,利用BLAST进行同源序列比对分析。结果表明:嗜酸乳杆菌β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中被认为对底物识别和结合重要的氨基酸残基保守区域位于第210~214位,分别为Tyr(Y)、Gln(Q)、Ser(S)、Gly(G)、His(H)。通过构建β-葡萄糖苷酶的系统发育树,并对其进行同源性比对分析。结果表明:嗜酸乳杆菌β-葡萄糖苷酶与来自嗜酸乳杆菌ATCC 4796的水解酶HMPREF0492(登录号EEJ75268.1)同源性最高,且与该序列具有最高的亲缘性;其次是乳酸菌DSM 20249(登录号KRK76876.1)与其氨基酸序列一致性为100%;与多粘类芽孢杆菌(登录号SUA71531.1)和多粘类芽孢杆菌SQR-21(登录号AHM67667.1)的亲缘关系最远。(5)β-葡萄糖苷酶的二级结构分析利用PSIPRED和WOLF SOPMA在线分析软件,对蛋白的二级结构进行预测。结果表明:PSIPRED预测蛋白二级结构中24.88%α-螺旋,15.26%β-折叠,无规则卷曲元件贯穿于整个氨基酸序列中。WOLF SOPMA预测蛋白二级结构主要由46.95%无规则卷曲元件、29.58%α-螺旋、17.37%β-折叠、6.10%β-转角构成。因此可知,该蛋白的二级结构主要由α-螺旋结构、β-折叠结构、无规则卷曲元件组成。3、β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达、纯化及圆二色谱分析采用PCR体外扩增技术获得β-葡萄糖苷酶的目的基因,将目的基因片段同载体PET-28a(+)进行双酶切、连接、转化、阳性克隆筛选,得到的重组载体PET-28a(+)-bgl导入感受态大肠杆菌中诱导表达。采用超声破碎菌体,经镍亲和层析柱层析、透析袋过夜透析、PEG 20000浓缩、微滤膜浓缩,再利用SDS-PAGE法、蛋白印迹法验证蛋白纯度。将纯化后的目标蛋白采用圆二色谱法,测定其二级结构。结果表明:重组β-葡萄糖苷酶被成功表达且纯度达到电泳纯,β-葡萄糖苷酶浓度为1.88 mg/mL。在190-260 nm远紫外区,β-葡萄糖苷酶的二级结构中α-螺旋结构占15.9%,β-折叠占44.1%,β-转角占18.1%,无规则卷曲元件占27.2%。4、β-葡萄糖苷酶酶学性质研究(1)β-葡萄糖苷酶的最适反应温度及其热稳定性探究野生型酶与重组酶在20℃~90℃的最适反应温度,并将其在不同温度下孵育处理,研究野生型酶与重组酶的热稳定性。结果表明:野生型酶与重组酶最适反应温度均为47℃。野生型酶和重组酶在20℃~50℃时均具有较好的热稳定性。该酶具有较好的耐热性、热稳定性。(2)β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及其pH稳定性探究野生型酶与重组酶在催化反应体系pH 2.2~8.0的最适反应pH,并将其在不同pH条件下静置4 h后,研究野生型酶与重组酶的pH稳定性。结果表明:野生型酶与重组酶的最适反应pH差异较小,野生型酶最适反应pH值为5.0,重组酶最适反应pH值为5.6。野生型酶和重组酶均在pH 2.2~6.0时,具有一定的pH稳定性。该酶不仅具有广泛的pH稳定性,而且具有一定的耐酸性。(3)有机溶剂对β-葡萄糖苷酶的影响探究无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮4种有机溶剂对野生型酶、重组酶酶活的影响。结果表明:甲醇、乙酸乙酯、丙酮对β-葡萄糖苷酶的抑制作用较强;无水乙醇对野生型酶、重组酶的抑制作用相对较弱。(4)金属离子对β-葡萄糖苷酶的影响探究Na~+、Ka~+、Li~+等金属离子对野生型酶与重组酶的影响。结果表明:Na~+、Ka~+、Li~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Al~(3+)对野生型酶及重组酶均有不同程度的抑制作用。Ka~+、Li~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)对β-葡萄糖苷酶的抑制作用相对较小,Hg~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Ba~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)对野生酶及重组酶的激活作用较为显著。Fe~(3+)、Fe~(2+)对野生型酶及重组酶的促进作用更为突出,Na~+、Al~(3+)对野生型酶及重组酶的抑制作用较强。(5)β-葡萄糖苷酶对葡萄糖、NaCl的耐受性研究探究不同浓度葡萄糖及NaCl,对野生型酶及重组酶的影响。结果表明:1.5 mol/L葡萄糖促使野生型酶和重组酶的酶活达到最大值,相对酶活分别增加84.30%、39.01%。重组酶较野生型酶的耐糖性更好,适用于后续应用开发。2.0 mol/L NaCl对野生型酶、重组酶的酶活具有一定的激活作用,分别使其酶活提高79.11%、51.40%。NaCl对重组酶的耐受性较野生型酶强。(6)β-葡萄糖苷酶动力学参数分别以p-NPG、芦丁、异槲皮素为底物与重组酶和野生型酶相互作用,探究不同底物与β-葡萄糖苷酶的动力学参数米氏常数K_m及最大反应速率V_(max)。结果表明:重组酶和野生型酶与p-NPG反应时,K_m值分别为0.204 mmol/L、0.684 mmol/L,V_(max)值为0.133mmol/L.min、0.662 mmol/L.min。当野生型酶与Rut、Iso催化反应时,K_m值为1.000 mmol/L、0.601 mmol/L,V_(max)值为1.340 mmol/L.min、1.157 mmol/L.min;当重组酶与Rut和Iso催化反应时,K_m值为0.357 mmol/L、0.326 mmol/L,V_(max)值为0.822 mmol/L.min、1.030 mmol/L.min。因此,可知重组酶与p-NPG间的亲和能力较野生型酶强,K_(m(Rut))K_(m(Iso))表明Rut与β-葡萄糖苷酶相互作用时亲和能力更好。5、β-葡萄糖苷酶与槲皮素糖苷底物相互作用的荧光光谱分析采用荧光光谱、紫外吸收光谱、同步荧光光谱法,探究Rut和Iso与β-葡萄糖苷酶的结合方式,Rut和Iso对β-葡萄糖苷酶的淬灭作用机制,以及二者对该蛋白酶构象变化的影响等。结果表明:(1)β-葡萄糖苷酶与Rut及Iso的结合距离r分别为4.52×10~-33 nm、3.65×10~-33 nm,均小于7 nm且r_((Rut))r_((Iso))。可推断Rut及Iso同β-葡萄糖苷酶间存在非辐射能量转移,且Iso与β-葡萄糖苷酶相互作用时结合距离较Rut更近,更利于Iso同β-葡萄糖苷酶的相互结合作用。由于β-葡萄糖苷酶与槲皮素糖苷底物间的非辐射能量转移,促使β-葡萄糖苷酶的内源性荧光强度被降低,产生荧光淬灭现象。(2)Rut和Iso对β-葡萄糖苷酶的荧光淬灭作用符合静态淬灭机制,Rut的淬灭常数K_(SV)为6.13×10~5 L/mol,速率常数K_q为6.13×10~133 L/mol;Iso的K_(SV)为3.13×10~5 L/mol,K_q为3.13×10~133 L/mol。Rut对β-葡萄糖苷酶的淬灭常数大于Iso,说明Iso对β-葡萄糖苷酶的荧光淬灭作用较Rut强,且对β-葡萄糖苷酶的构象存在不同程度的影响。(3)当Δλ=15 nm时,Rut-β-葡萄糖苷酶体系的最大发射波长蓝移(284→279 nm);Iso促使β-葡萄糖苷酶体系的最大发射波长蓝移(278→277 nm),表明Tyr残基所处微环境的疏水性增强。当Δλ=60 nm时,Rut与Iso对β-葡萄糖苷酶Trp残基所处微环境的影响不明显。同时,在相同荧光淬灭条件下,Iso对Trp残基的同步荧光淬灭作用较Rut强,但Rut对β-葡萄糖苷酶的Tyr残基微环境的疏水性影响较大。(4)Rut和Iso同β-葡萄糖苷酶相互作用时Rut和Iso与β-葡萄糖苷酶结合常数Ka分别为0.50×10~7 L/mol、0.31×10~7 L/mol,表明Rut同β-葡萄糖苷酶的结合作用较Iso强。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：
1999 年）。芦丁又名槲皮素-3-O糖组成；异槲皮素又名槲皮素-3-O-葡素、芦丁、异槲皮素化学结构式见图化合物，但极少数以游离态（槲皮素苷）的形式广泛存在（孙慧慧，20153-O-芸香糖苷（芦丁），3-O-鼠李糖糖苷（螺旋花苷）（Middleton，1998 中生物利用度较低（Fujimori 等人，更高的生物利用率（刘萍等人，2006 皮素糖苷（Nile 等人，2017 年），也与在摄取后几乎不被吸收。黄酮是刺梨其主要构成成分，因此槲皮素糖苷的
大多数以结合态（槲皮素糖苷）的形式广泛存在（孙慧慧，2015 年）。其中最常见的是 3-O-葡萄糖苷（isoquercetin），3-O-芸香糖苷（芦丁），3-O-鼠李糖苷（槲皮苷）和 3-O-半乳糖苷（金丝桃苷），4'-O-葡糖苷（螺旋花苷）（Middleton，1998 年）。槲皮素易于溶解，但溶解速率低，导致在胃肠道中生物利用度较低（Fujimori 等人，2015 年）。相关研究证明，黄酮苷元比黄酮糖苷具有更高的生物利用率（刘萍等人，2006 年），槲皮素在体内的生物利用率及抗氧化活性优于槲皮素糖苷（Nile 等人，2017 年），也与糖苷存在的位置有关（Lee等人，2016 年），且糖苷在摄取后几乎不被吸收。黄酮是刺梨中重要功能成分，其中游离态槲皮素和键合态槲皮素是其主要构成成分，因此槲皮素糖苷的高效水解转化对提高刺梨功能具有重要意义。图 1-1 黄酮类化合物的化学结构式Fig.1-1 Molecular structures of Flavonoids.
图 1-3 Rut 酶解为 Iso 和 Que 的转化途径Fig.1-3 Hydrolytic pathway from Rut to Que and Iso1.2.3 黄酮苷元的β-葡萄糖苷酶酶解转化因此，如何通过去糖基定向修饰黄酮类化合物分子结构，高效释放苷元，是提高黄酮特定功能及其生物利用率的重要途径。目前，制备黄酮苷元多采用化学法，如醚化、酯化、酰基化等化学衍生化反应水解黄酮糖苷生产黄酮苷元。但是这些反应过程往往屏蔽了黄酮化合物的主要官能团——酚羟基，不利于产物的抗氧化作用（高金明等人，1998 年；王秋安，1999 年），同时化学法产物较为复杂，黄酮类化合物水解产物的安全性有待于进一步研究。
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2883507
