F-8脱氧核酶酶学研究

发布时间：2020-11-15 12:52

　　 核酸是生物体内携带遗传信息的生物大分子,20世纪80年代,托马斯·切赫(Thomas Cech)和西德尼·奥尔特曼(Sidney Altman)等发现了具有催化活性的RNA分子,并将其命名为核酶(ribozyme或RNAzyme)。核酶作为一种非蛋白质酶,它的发现对于酶学的研究以及RNA功能与结构的探索起到了重要推动作用。1994年,由杰拉尔德·乔伊斯(Gerald Joyce)和罗纳德·布瑞克(Ronald Breaker)通过体外筛选技术获得一种可以催化RNA断裂的单链DNA分子,他们将这类能够起到催化作用的DNA分子称为脱氧核酶(deoxyribozyme或DNAzyme)。随着对其功能研究的深入,结构方面的探索也日益增加,目前已发现了10-23脱氧核酶、9DB1脱氧核酶、8-17脱氧核酶的晶体结构。脱氧核酶的种类日益增加,应用领域也逐渐广泛。近年来,利用其结构的优越性已经在基因沉默、生物传感器、DNA折纸(DNA Origami)等领域有了广泛应用。2014年,唐卓研究员实验室通过体外筛选获得了一种名为F-8的新型DNA断裂活性脱氧核酶。我们以F-8脱氧核酶序列和二级结构为基础,设计顺式结构的F-8SL脱氧核酶,鉴定发现了该脱氧核酶多种新辅因子与抑制因子,进而分析探讨其反应机制;明确断裂位点、磷酸基团归属及对电泳迁移速度影响;表征了催化核心单位点突变与活性关系。首先,我们检测维生素类、酚类、胺类等25种化合物对F-8SL脱氧核酶断裂活性的影响。鉴定“维生素C/锰离子”组合为F-8SL脱氧核酶最佳辅因子,黄素单核苷酸(FMN)、荧光素钠可以与光照产生协同作用大幅提高脱氧核酶的催化活性。其他新辅因子邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、间苯三酚、邻苯二胺、羟胺与锰离子共同作用下也能够在不同程度上促进F-8SL脱氧核酶断裂催化活性。随后,我们对F-8SL脱氧核酶的断裂机制进行了分析探讨,分别检测了羟自由基、过氧化氢、超氧阴离子(O_2~(·–))在反应过程中所起的作用。利用铁卟啉-过氧化氢,鸟嘌呤四链体-铁卟啉-过氧化氢体系,对于羟自由基所起作用进行了探究,数据显示羟自由基没有参与反应过程。利用过氧化氢酶(CAT)抑制实验,证明过氧化氢在脱氧核酶的断裂反应过程起到重要作用,并通过能产生过氧化氢的过氧碳酸钠、“葡萄糖/葡萄糖氧化酶”组合进一步证明。利用过氧化氢/锰离子、维生素C/锰离子,邻苯二胺/锰离子,对苯二酚/锰离子反应体系进行超氧阴离子抑制实验,加入超氧化物歧化酶后有抑制活性作用。在此基础上,我们推测并验证了氮蓝四唑或蛋白质细胞色素C也能够具有较强的抑制脱氧核酶活性。这些实验数据显示在DNA氧化断裂过程中超氧阴离子可能起到关键性作用。此外,断裂位点研究过程中,我们以F-8SL为基础设计并优化出F-8SR1、F-8SR2以及F-8SR3三种脱氧核酶,利用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳以及飞行时间质谱,对DNA断裂位点进行了研究,鉴定F-8SL脱氧核酶断裂片段5’末端、3’末端带有磷酸基团。携带磷酸基团单链DNA电泳速率快慢与其脱氧核苷酸组成有关联,并非都呈现电泳速率加快现象。最后,对脱氧核酶催化中心的12个碱基进行了单位点突变研究,在四组不同辅因子条件下检测了突变位点与催化活性关系,数据显示脱氧核苷酸A4、T5、C6位点表现出高度的非保守性,为我们进一步设计“光调控活性脱氧核酶”提供了明确的改造位点。在本论文中,我们获得了F-8SL脱氧核酶的多种辅因子和抑制因子,提出了其可能的催化机制,分析了断裂位点,明确了催化核心中非保守性的核苷酸。断裂位点分析以及催化核心单位点突变体的研究为后续的人工设计新型结构脱氧核酶奠定了基础。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q55
【部分图文】：

第 1 章 绪论开关(thiaminepyrophosphateriboswitch，TPPribosw位于大肠杆菌 mRNA 的 5’端非编码区，可以直接结有蛋白质分子的参与情况下，这个 mRNA 是编码维杆菌就可以通过感受焦磷酸硫胺素含量来调节维生核开关有维生素 B12 核糖开关、黄素单核苷酸核开核开关、鸟嘌呤核开关、腺嘌呤核开关等。

吉林大学硕士学位论文部位并束缚住这两个亚结构单元。晶体结构显示 P1部位，其中 P1 穿过 P2 核心结合配体，这个重要局撑，P3-P4 区可以在低浓度镁离子情况下协助催化核核酶）是已知的唯一依赖小分子活化的天然催化活，被葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate，GlcNA 磷酯转移发生自身断裂反应，进而调控降低葡糖减少葡萄糖胺-6-磷酸的合成量，作用机理如图 1.2 所的葡糖胺-6-磷酸合成酶的代谢产物。葡糖胺-6-磷LCNAC）生物合成的第一步产物，而 UDP-N-乙酰基分子。

-17 和 10-23 脱氧核酶从多个角度展开大量的基础研究，断裂位点分析[25, 26]、催化核心突变[27-29]、脱氧核苷酸修-49]、晶体结构[50, 51]、催化机制[52-59]等方面。这些研究直的应用研究。本实验室曾将脱氧核酶插入到单链 DNA 载基因表达[60, 61]。更多的研究人员集中在基于脱氧核酶构年来向细胞内金属离子[62-64]、RNA[65-67]以及蛋白质[68]检还有的研究人员擅长利用脱氧核酶设计分子逻辑门（logi）[70]，这丰富了脱氧核酶的应用领域。西奥尔卡（Jerzy Ciesio ka）研究团队通过体外筛选获得的脱氧核酶，称之为 Dz15，如图 1.3 所示[71]。该脱氧核需要金属离子的参与，并且在反应溶液酸性条件下（pH大于 5.0 时则完全失去活性。
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本文编号：2884782