纳豆芽孢杆菌胞壁肽聚糖的提取分离、结构表征及其免疫活性研究

发布时间：2020-11-15 15:18

　　 纳豆芽孢杆菌是从日本纳豆中分离的益生菌,属于枯草芽孢杆菌的亚种。其活菌制剂以及产生的代谢物质具有重要的生理功效而被广泛关注。肽聚糖是原核细胞壁的特殊成分,真核细胞不含肽聚糖,因此肽聚糖是真核免疫系统识别的理想靶标。肽聚糖识别分子可以诱导免疫调节物质的释放,从而起到免疫调节作用。为了探索纳豆芽孢杆菌胞壁肽聚糖免疫调节功能,本文研究了纳豆芽孢杆菌胞壁肽聚糖提取分离条件,初步分析了其理化性质和结构特征,研究其对小鼠免疫功能的影响,主要研究结果如下:1.优化纳豆芽孢杆菌细胞壁的提取条件以实验室保存的纳豆芽孢杆菌为研究材料,经增值培养,通过Box-Behnken试验设计和响应面分析确定超声辅助提取的最佳工艺参数为:超声波功率为314W,处理时间27min,OD600为0.66,在此条件下细胞壁最大提取得率为44.51%。2.纳豆芽孢杆菌细胞壁肽聚糖的制备及化学结构分析以得到的纳豆芽孢杆菌细胞壁为原料,经过三氯乙酸法,先后去除细胞壁中的磷壁酸、脂类物质、蛋白质,在经过透析,得到得率为8.5%的肽聚糖。通过溶菌酶实验、Bradford法、香醛法、苯酚-硫酸法、对肽聚糖组成成分进行分析。通过红外光谱和SDS-PAGE研究纳豆芽孢杆菌肽聚糖的结构。分析结果表明:糖总量为39.77%,蛋白质占54.47%,总脂质含量为4.5%。溶菌酶处理后,可溶性肽聚糖的分子量约为60kD。通过HPLC图谱分析,确定了溶解物的出峰时间与标准的肽聚糖溶解物出峰时间一致。其糖链结构由N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4-糖苷键连接而成。3.纳豆芽孢杆菌肽聚糖对小鼠免疫功能的影响挑选体质康健的昆明小鼠96只,体重18～22 g,随机分为空白对照组、肽聚糖溶液低、中、高剂量组,每组24只。饲养周期7d,每24h注射一次,检测不同剂量组对小鼠免疫指标及其细胞因子分泌量的变化情况。根据SPSS分析结果表明:纳豆芽孢杆菌肽聚糖可显着提高小鼠的免疫器官指数;肽聚糖可显著增加血清溶血素含量,小鼠碳清除指数和迟发型超敏反应,并对小鼠脾淋巴细胞的增殖及腹腔巨噬细胞吞噬能力均有增强效果;肽聚糖各剂量组均能提高巨噬细胞的代谢活力,极显著增加IL-2、IL-10、IFN-r、TNF-α的分泌量,提高NO和iNOS的表达量。
【学位单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：

肽聚糖由聚糖链、双糖残基和交联肽的侧链组成，形成结构致高的网状。近几年中，国内外研究者对肽聚糖的化学结构、生理学活性研究，但是了解的仍然非常有限。聚糖的结构聚糖（peptidoglycan）是一种大分子复合物，具有由二糖单元，四肽尾稳定结构。肽聚糖的主要骨架是由 N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosam-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid 简写 M)通过β-1，4 糖苷键交替相联聚糖链（图 1-1）[45]。聚糖链交联通常直接或通过位于 4 位的 D-Ala 的的氨基酸的氨基之间的短肽桥发生[46]。聚糖链的长度也因菌种的不同存为 9 个二糖单位，最长的达到 170 多个二糖单位；1 个二糖单位约长 长度可从 100 埃到 1700 埃左右。每个四肽链之间都相互交联。在革兰多数是两条肽聚糖的肽链直接交联，占肽链总数的 50%。而革兰氏阳性一条肽桥交联[47]。聚糖是具有独特生物物理性质的袋状分子。它可以抵抗细胞的震动，在膨胀，空隙较宽，可以使大分子物质扩散出来。根据应用程序的测定，度约是 1.5-15nm[48]。

调节免疫，是由 B 淋巴细胞介导产生复杂，大致分为三个阶段，首先是抗原决定簇，然后通过刺激 T 细胞化成浆细胞和记忆细胞。接着是反值分化，形成效应 B 细胞，其中用，为同样抗原的入侵起到快速保以与相应的抗原特异性结合，最终有显著的体液免疫调节作用。沈柱能的影响,研究表明，肽聚糖中、（P＜0.05，P＜0.01），高剂量组等腹腔注射给药对小鼠免疫器官绝反应显示，肽聚糖组足垫厚度较对长发育，提高机体对特异性抗原的

1.3.2 肽聚糖对细胞免疫调节细胞免疫，也称细胞介导的免疫，是由 T 细胞介导的免疫反应，即在 T 细抗原刺激后，分化、增殖和转化成为致敏 T 细胞，当同一抗原重新进入机体时，或协同杀死敏感 T 细胞及其释放的细胞因子的免疫效应。反应过程分为感应、反效应三个阶段（图 1-3），类似于体液免疫。研究表明，枯草芽抱杆菌可以显著小鼠外周血和脾脏中的 CD3+ CD4+和 CD3+ CD8+T 淋巴细胞百分比，CCD4+/CD3+ CD8+比值也显著高于空白对照组，这表明肽聚糖可明显促进淋巴细殖，从而提高淋巴细胞免疫活性，使机体细胞免疫能力提高，改善机体的免疫防态盛琴[68]。纳豆芽孢杆菌胞壁肽聚糖的提取分离、结构表征及其免疫活性研究
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本文编号：2884905