DOC-1R蛋白结合CK2α与PRDX1及其结合区域的初步分析

发布时间：2020-11-16 22:15

　　 目的:本科室前期通过质谱检测发现,DOC-1R(Deleted In Oral Cancer-1 Related)可能与酪蛋白激酶2(Casein Kinase 2,CK2)的α亚基及过氧化物酶1(peroxiredoxin 1,PRDX1)具有相互作用,本研究通过Pull-Down、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)等方法证实DOC-1R与CK2α及PRDX1的相互作用,并通过构建DOC-1R截短蛋白载体及Pull-Down分别初步探究DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的结合区域,为进一步研究DOC-1R的生物学功能及其作用机制奠定基础。研究方法:1 GST Pull-Down分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的结合将转化有pGEX-5X-1及重组载体pGEX-DOC-1R的E.coli BL21菌株进行诱导表达,所得到的菌体裂解后收集GST蛋白及GST-DOC-1R融合蛋白,与MagneGST particle混匀孵育,加入HEK-293细胞总蛋白进行GST Pull-Down实验,Western Blot分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的结合情况。2 Co-Ip分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的相互作用常规培养DOC-1R及对照病毒感染的HeLa细胞,裂解细胞获得总蛋白,分为两个实验组:分别用FLAG抗体、CK2α抗体或PRDX1抗体进行免疫共沉淀反应,通过Western Blot方法分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的相互作用。3构建缺失型DOC-1R原核表达载体,诱导表达重组蛋白并通过GST Pull-Down分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的结合区域以本室前期构建的pGEX-DOC-1R质粒为模板,分别构建pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63三种缺失型DOC-1R原核表达载体。经菌落PCR鉴定,扩大培养阳性克隆菌落,提取质粒进行酶切鉴定后对三种缺失型pGEX-DOC-1R重组表达载体进行DNA测序分析。将编码序列正确、开放阅读框架完整的三种缺失型pGEX-DOC-1R重组表达载体转化E.coli BL21感受态细胞中,诱导表达并收集菌液。将菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并脱色以检测融合蛋白的表达情况。将新构建的三种含有缺失型DOC-1R的大肠杆菌(pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63)、本科室前期构建及保存的含有缺失型DOC-1R的大肠杆菌(pGEX-DOC-1RdelC63、pGEX-DOC-1RdelC30、pGEX-DOC-1RdelC20、pGEX-DOC-1RdelC7)及对照菌分别诱导表达,并将得到的菌液裂解,收集融合蛋白,与MagneGST particle混匀孵育,4 h后加入HEK-293细胞总蛋白混匀孵育过夜,Western Blot分别检测缺失型DOC-1R蛋白与CK2α及PRDX1的结合。结果:1 GST Pull-Down实验证明DOC-1R分别结合CK2α及PRDX1蛋白通过Pull-down及Western Blot实验,证实DOC-1R分别与CK2α及PRDX1蛋白结合,同时我们在洗脱物中应用CK2β抗体检测到了CK2β的存在。2 Co-Ip实验证明DOC-1R分别与CK2α及PRDX1相互作用通过Co-Ip和Western Blot实验,检测可知DOC-1R分别与CK2α及PRDX1蛋白存在相互作用。3构建缺失型DOC-1R原核表达载体并诱导表达重组蛋白以分别初步确定DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白结合的关键区域截短的DOC-1R片段已经成功插入pGEX-5X-1载体中,目的片段序列正确且开放阅读框架完整,截短的DOC-1RdelN42、DOC-1RdelC42、DOC-1RdelN63在37℃诱导3 h时均大量表达。DOC-1R第107-119位氨基酸区域结合CK2α蛋白,且DOC-1R第85-126位氨基酸区域结合PRDX1蛋白。结论:1.应用GST Pull-Down和Co-Ip技术证实DOC-1R分别与CK2α及PRDX1相互结合。2.应用重组技术及GST Pull-Down技术证明,DOC-1R与CK2α结合区域在DOC-1R的第107-119位氨基酸区域,DOC-1R与PRDX1蛋白的结合区域在DOC-1R的第85-126位氨基酸区域。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

中国医科大学硕士学位论文取生长状态良好的感染了 Lv-DOC-1R 及对照病毒的人宫颈癌细胞系 HBS 清洗 3 次，加入 500 μl RIPA 细胞裂解液，冰上裂解细胞，将细胞收集内，4℃条件下 12,000 rpm 离心 15 min，吸取上清备用。分为两个实验组，分别用 Protein G PLUS-Agarose 和 Anti-Flag Affinity Gel 进行 Ip 实验，用相应抗体进行 Western Blot 检测，从而确定 DOC-1R 分别与 CK2α及 P互作用。0 缺失型 DOC-1R 引物的设计与合成利用人 DOC-1R 基因的 cDNA 序列进行引物的设计，5’端引物引入 Bam点，3’端引物包含终止密码子并引入 XhoⅠ酶切位点，设计了三对缺-1R 引物，分别缺失 DOC-1R 的第 1-42、85-126、1-63 位氨基酸编码基因 1）。

中国医科大学硕士学位论文3 实验结果Pull-Down 结合 Western Blot 分别证实 DOC-1R 与白在体外存在结合谱实验检测结果提示 CK2α、PRDX1 可能分别结合 DOC-1RPull-Down 法分别检测二者与 DOC-1R 的结合，用 CK2α抗抗进行 Western-Blot 鉴定，结果显示在体外，CK2α及 PRDOC-1R 结合（图 2，图 3）。同时我们在洗脱物中应用 CK2存在（图 2）。

图 3 在体外 DOC-1R 结合 PRDX1 蛋白结合Western Blot分别证实DOC-1R与CK2α及PRD在相互作用状态良好的感染了Lv-DOC-1R及对照病毒的人宫颈癌细胞，分为两个实验组，分别用 Protein G PLUS-Agarose 及ffinity Gel 进行 Ip 实验，在本实验条件下实验组中 CK2αC-1R 目的条带均能被检测到，而对照组未检测出目的蛋白， 分别与 CK2α及 PRDX1 具有相互作用（图 4，图 5）。
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本文编号：2886733