多聚唾液酸转移酶ST8SIA4中PSTD区域的结构与功能分析

发布时间：2020-11-21 22:22

　　 唾液酸转移酶家族是糖基转移酶超家族的重要成员,其广泛分布于细菌、古细菌及真核细胞生物中,被认为是起源古老的转移酶家族之一。在真核细胞中唾液酸转移酶属于GT29家族,通过糖基化修饰位点与靶点不同,可分为六个亚家族。尽管GT29家族成员众多,但在高等生物,只有ST8SIA2(STX)和ST8SIA4(PST)两个转移酶具有多聚唾液酸化修饰功能,而其它成员仅以单聚或寡聚糖为主。独特的多聚唾液酸功能域(PSTD)与位点识别功能域(PBR)赋予了 ST8SIA2与ST8SIA4酶的多聚化功能。目前已经报道多种蛋白可被多聚唾液酸转移酶所修饰,神经细胞黏附因子(NCAM)是其主要的载体,并涉及神经发育、认知、免疫、肿瘤、微生物侵染等重要的生物功能。特别是多聚唾液酸糖基化修饰是肿瘤细胞的普遍特征,并与肿瘤细胞的侵袭、转移有关。因此,以多聚唾液酸转移酶为靶点的药物开发为抗肿瘤提供了一新的途径。目前,由于缺乏转移酶抑制靶点与作用机制的信息,限制了对其在不同领域中的开发与利用。本文以多聚唾液酸转移酶中PSTD与PBR两个重要的功能域为主要研究对象,以分子进化、核磁结构解析与分子模拟等为主要研究方法,拟通过多角度探索多聚唾液酸转移酶的进化机制与其结构信息,为其功能与机制的探索提供一定的认识。从进化的角度,通过对ST8SIA4与ST8SIA2两个多聚唾液酸转移酶的功能分化分析,观察到两个基因分化主要源于氨基酸的理化性质的差异,在ST8SIA4酶中主要分布于86-104区域,该区域位于多聚底物结合的PBR区域中。考虑PBR主要识别特异性蛋白修饰位点,ST8SIA4与ST8SIA2两个酶的功能分化主要源于对不同修饰靶点的识别上。而在PSTD功能城上,在ST8SIA2与ST8SIA4中均比较保守。通过其功能分化分析,ST8SIA2与ST8SIA4在不同的功能域上可能受不同的选择作用,进一步的位点选择模型分析,支持了在ST8SIA4在进化过程中受到正选择的作用,并正选择的位点主要分布在PBR功能域附近。通过对PSTD区域的NMR结构解析,发现PSTD主要由L260-K272共13个氨基酸形成的α-螺旋组成,在N端(L258-R259)及C端(K272-S279)氨基酸片段上为无结构区域。为了进一步研究多聚唾液酸(PSA)与PSTD的结合,同时解析了 PSA存在下的结合态结构。通过两者结构的比对,在底物加入后,N端的L260-H262,C端的K272至C末端两个区域存在着明显的差异。1H-15N-HSQC谱图能够观察到两种状态下,在多个非碱性氨基酸位点,如L260、1261、G266、W268、L269、N271均有不同程度的结合。这表明多聚唾液酸与PSTD的结合过程中,其表面上的非碱氨基酸在结合底物或糖链延伸过程中,同样起着重要的作用。在该结构基础上,通过分子对接的方法进一步的发现,在野生型的PSTD中,PSA可以静电、氢键的方式与其PSTD功能域上氨基酸进行结合。对其非碱性氨基酸位点突变后,会影响到PSA与PSTD上氨基酸结合位点与结合方式。通过PSTD与酸性多糖(肝素、多聚唾液酸、透明质酸、硫酸软骨素)及小分子(唾液酸、CMP)的结合实验,发现PSTD与肝素、硫酸软骨素、多聚唾液酸等酸性多糖之间均有结合作用。在此基础上,进一步分析了肝素与PSTD主要为静态结合方式,其结合的位点位于螺旋结构上的L260、Y267、W268与L269等非碱性氨基酸位点。小分子CMP及其衍生物与PSTD域同样有结合能力,其主要也为静态结合,但其结合能力较肝素弱。由于以上几个酸性多糖与小分子CMP对抑制肿瘤侵润、迁移等有重要作用,其PSTD区域可能为其重要的作用靶点。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q936
【部分图文】：

中起着重要的作用｜２１］。因此，对糖链结构与生物学作用的研宄，可揭示多细胞生物中一??些高层次生命活动现象。??１．３唾液酸及其糖缀合物??１．３．１唾液酸单体??表１－２常见唾液酸种类与其命名??Ｔａｂｌｅ?１－２?Ｃｏｍｍｏｎ?ｓｉａｌｉｃ?ａｃｉｄｓ?ｉｎ?ｃｅｌｌｓ???中文名?常用缩写名???Ｎ－乙酿神经氦酸?ＮｅｕＡｃ，Ｎｅｕ５Ａｃ，ＮＡＮＡ??Ｎ－轻乙酰神经氨酸?ＮｅｕＧｃ，ＮＡＮＧ，Ｎｅｕ５Ｇｃ??去氨基神经氨酸?ＫＤＮ??神经氨酸?Ｎｅｕ???Ｓｉａｌｉｃ?Ａｃｉｄｓ??

｜５１］??１．３．３唾液酸的正常生理功能??在脊椎动物中，唾液酸化的糖蛋白是种类最多，结构最为复杂的缀合物（如图１－４），??Ｖａｒｋｉ将其划分为五个不同层次的水平复杂性（图１－４）?［２８］。尽管目前我们已获得大量糖??缀合结构与功能的知识，但相对于全局现在还是冰山一角［２，《，５３］。其结构的复杂性赋予??唾液酸糖缀合物极其复杂的生理功能［２］。由于具有亲水性和负电荷性，主要作为生物信??息传递分子，参与细胞与细胞间、细胞与大分子间的相互作用，进而在生长发育，细胞??６??

?＾?Ｓａｃｃｔｉａｒｉｄｅ?ｐｍｃｔｉ＊??图１－４多聚唾液酸的结构复杂性［Ｕ??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ＇１＇??粘附、信号传导、抗原识别和膜受体等方面发挥功能｜２１。如在红细胞中，唾液酸的存在??使其细胞呈负电荷，避免了在循环系统中细胞间的相互作用。此外，在肾小球外膜的唾??液酸对维持细胞的过滤起到重要作用。由于其功能涉及广泛，如在红细胞黏连、神经发??育、癌症形成、病原体侵染［５４１、免疫［５５１、炎症等方面。以下着重阐述唾液酸修饰与病??原体、唾液酸与免疫、唾液酸与祌经发育的关系。??（１）唾液酸抵御病原体的功能??病原体在侵染宿主细胞过程中，在结合宿主、逃避宿主免疫系统、定殖后释放过程??中均与唾液酸发生直接关系［５６１。在侵染过程中，首先需要病原体表面的糖蛋白与受侵染??细胞表面聚糖特异性结合，由于唾液酸分布广泛，且定位于糖缀合物的末端曝露于细胞??表面，因此成为病原微生物攻击的重要靶点［５７］。以流感病毒为例，主要通过表面血凝素??（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）与唾液酸结合。针对不同的侵染对象
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本文编号：2893687