新型多糖水解酶的基因挖掘及催化机理研究

发布时间：2020-12-16 23:44

　　酶解木聚糖是生物制备木寡糖（益生元）的主要方法之一。然而,由于主链与侧链交联形成的网络化结构,致使木聚糖需要复杂的多酶协同催化才可实现有效降解。因此,挖掘兼备降解木聚糖主链和侧链的双功能酶具有重要意义。本研究利用基因挖掘策略获得了双功能乙酰酯-木糖苷水解酶（CLH10）。CLH10的氨基酸序列包含离散的保守酯酶序列片段和保守糖苷酶序列片段,系单序列结构域双功能酶。晶体结构揭示CLH10的氨基酸序列折叠形成了一个球形蛋白分子,该分子的两个独立结构区域分别承担了其对于乙酰酯和木糖苷类底物的识别催化能力。因此,CLH10具备“一酶多用”作用于木聚糖主链和侧链高效酶解乙酰化木聚糖分子,进而制备木寡糖的应用潜力。值得注意的是,CLH10是一个保守的酯酶分子,其β-1,4-木糖苷键水解活力的获得机制为,基于酯酶结构骨架的Loop结构区域偶然获得了糖苷键水解关键残基对（Asp10\Glu139）,且灵活的Loop结构实现了对于木糖苷底物的有效识别。上述发现提示,以酶分子的Loop区域作为定向进化或理性设计靶向区域可成为拓展酶催化功能的潜在研究焦点。 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：73 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 绪论
    1.1 引言
    1.2 糖苷水解酶
        1.2.1 糖苷水解酶的定义及催化机制
        1.2.2 β-1,4木糖苷键水解酶
    1.3 碳水化合物酯酶
        1.3.1 碳水化合物酯酶的定义及催化机制
        1.3.2 阿魏酸酯酶
    1.4 木聚糖的协同酶解
    1.5 双功能酶的底物识别和催化机制
    1.6 双功能乙酰酯-木糖苷水解酶的分类
    1.7 酶的理性设计和定向进化
    1.8 本研究工作思路
2. 材料和方法
    2.1 实验工作部分
        2.1.1 主要实验材料和试剂
        2.1.2 载体构建和蛋白表达
        2.1.3 蛋白纯化
        2.1.4 晶体制备及优化
        2.1.5 晶体衍射
        2.1.6 定点突变
        2.1.7 酶活力检测
    2.2 计算工作方法
        2.2.1 序列挖掘
        2.2.2 氨基酸序列保守性分析
        2.2.3 晶体结构解析
        2.2.4 虚拟饱和突变文库构建
        2.2.5 分子对接
        2.2.6 分子动力学模拟
3. 实验结果及讨论
    3.1 目的基因挖掘
    3.2 目的蛋白表达纯化
    3.3 目的蛋白晶体优化及结构解析
    3.4 酶学性质表征
    3.5 底物识别及催化机制
    3.6 双催化功能行为关系
    3.7 双催化功能形成机制
4. 总结及展望
参考文献
个人主要学术成果
致谢



本文编号：2921002