毕赤酵母鼠李糖诱导型启动子P LRA3 特征解析及改良

发布时间：2020-12-21 02:55

　　毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一,组成型启动子P_GAP和甲醇诱导型启动子P_AOX1均能实现大多数外源蛋白的高效表达。然而,这两个启动子在调控重组蛋白表达时存在明显缺陷,如应用P_GAP时发酵过程不能精准调节,无法适用于毒性蛋白的表达;应用P_AOX1时需要以有毒易燃的甲醇为诱导剂,不适于医药食品相关重组蛋白的表达。因而,亟待开发新型启动子应用于毕赤酵母表达系统。实验室前期研究了Pichia pastoris鼠李糖代谢途径相关基因LRA1-LRA4及调控基因rhaR,发现LRA3基因的启动子P_LRA3可实现重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达,有望将其应用于毕赤酵母表达的工业生产中,但对P_LRA尚未进行深入研究。本文首先通过基因敲除和回补实验证实了rhaR参与毕赤酵母鼠李糖代谢;EMSA实验结果表明rhaR编码的蛋白RhaR可结合于P_LRA3,并揭示了其结合位点;通过CRRT-PCR方法揭示了P_LRA3的转... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

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国农业科学院硕士学位论文 第二章 rhaR 参与毕赤酵母鼠李糖代94℃ 30 s28 cycles 58℃ 30 s72℃ 2 min72℃ 10 min25℃ 2 min扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测，选择阳性转化子进行下一步实验。2.5 调控基因 rhaR 无痕敲除菌株的构建rhaR 基因无痕敲除菌株构建过程见图 2.2。外源 DNA 片段导入毕赤酵母后，基因组同源 DN段-AB 片段和 C 片段，与基因 rhaR 两侧片段进行双交换，将 rhaR 基因双交换下来，同时 A C 之间序列插入基因组中；第二次重组发生在基因组内，mazF 表达盒和 zeocin 表达盒两侧同 B 序列互补发生重组，将 mazF 表达盒、zeocin 表达盒和其中一个 B 片段删除，完成 rh因的无痕敲除。

72℃ 1025℃ 2 泳检测。基因 rhaR 敲除及回补菌株 及 GS115/rhaRC 划线于 MDH、基上生长差异情况。伸 PCR 连接，分别以 A-F（Swa1）/B-xR NA 片段：AB 和 C 片段，片段

【参考文献】：
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本文编号：2929053